研究背景

為了研究畢氏酵母發(fā)酵過程中基因的變化，吉林大學(xué)梁重陽團(tuán)隊(duì)以畢氏酵母對(duì)甲醇適應(yīng)性發(fā)酵rHSA(人重組白蛋白)過程為模型，研究了畢氏酵母發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)錄組學(xué)與關(guān)鍵發(fā)酵階段的關(guān)系。該研究最近以“Transcriptional Regulation of AerobicMetabolism in Pichia pastoris Fermentation”為題發(fā)表于著名學(xué)術(shù)期刊PLOS ONE，烈冰生信團(tuán)隊(duì)在測(cè)序和生信分析方面給予了有力的支持。
酵母發(fā)酵過程主要有5個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，1-(12h)-對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2-(30h)-甲醇取代甘油作為能源起始點(diǎn)，3-(48h)-酵母適應(yīng)甲醇生長(zhǎng)階段，4-(90h)-產(chǎn)物積累頂峰，5-(108h)-發(fā)酵結(jié)束和產(chǎn)物降解。酵母發(fā)酵過程有兩個(gè)關(guān)鍵階段，限制碳源替代和甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。限制碳源替代就是把酵母發(fā)酵的能源從甘油轉(zhuǎn)變?yōu)榧状?，酵母需要?jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)過程才能繼續(xù)生長(zhǎng)；甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)是酵母適應(yīng)了甲醇以后大批量生產(chǎn)蛋白及末期細(xì)胞凋亡和產(chǎn)物降解的過程。為了探究這兩個(gè)階段中基因發(fā)生的變化，分別取這兩個(gè)階段中三個(gè)重要的節(jié)點(diǎn)做了趨勢(shì)分析（1-2-3即限制碳源替代和3-4-5即甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)）。用GO-Term進(jìn)行聚類，最后通過co-exp-net鎖定一個(gè)與氧化還原代謝相關(guān)的基因PAS_chr2-1_0582，并通過同源重組的方法敲除目的基因，發(fā)現(xiàn)醇類消耗是對(duì)照組的1/5，過氧化物酶體生成也是減少的。

分析思路

實(shí)驗(yàn)取了5個(gè)不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的畢氏酵母，提取RNA，進(jìn)行測(cè)序，分別對(duì)1-2-3和3-4-5兩個(gè)階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，通過生物信息分析，鎖定目的基因，并通過基因敲除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證此基因在發(fā)酵過程中的核心地位。

１. 首先建立了甲醇誘導(dǎo)畢氏酵母發(fā)酵表達(dá)rHSA的經(jīng)典發(fā)酵模型。

2. 分別對(duì)1-2-3和3-4-5兩種結(jié)果進(jìn)行了趨勢(shì)分析，并對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集。發(fā)現(xiàn)1-2-3階段趨勢(shì)6和趨勢(shì)7（上升的趨勢(shì)）主要與囊孢子形成和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)，而趨勢(shì)0和趨勢(shì)1（下降的趨勢(shì)）主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。這與酵母發(fā)酵生長(zhǎng)曲線使一致的。而3-4-5階段趨勢(shì)5（先升后降）和趨勢(shì)3（先平后降）主要與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。

3. 分別對(duì)1-2-3和3-4-5兩個(gè)階段的相關(guān)基因做了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，找出核心基因。
1）對(duì)1-2-3階段 GO分析中192個(gè)相關(guān)的基因做動(dòng)態(tài)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，找出K-core值大于或等于10的29個(gè)核心基因，發(fā)現(xiàn)這些基因都集中分布在單一的子網(wǎng)絡(luò)，均為下降的趨勢(shì)，而這些基因均與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，這與發(fā)酵過程中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是一致的。

  2）對(duì)3-4-5 階段GO分析中231個(gè)相關(guān)的基因做動(dòng)態(tài)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，找出此階段核心基因，大多數(shù)核心差異基因與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。

4. 針對(duì)以上兩個(gè)階段的核心基因分別做了Go-Gene-Tree，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)階段都是與氧化還原過程相關(guān)的。
1）在1-2-3階段Go-Gene-Tree?？梢钥吹讲町惢蛑饕c需氧呼吸和三羧酸循環(huán)有關(guān)。

  2）在3-4-5階段Go-Gene-Tree，發(fā)現(xiàn)核心基因都是與氧化還原過程的步驟是相關(guān)的，比如有氧呼吸、電子傳遞鏈、NADPH生成等過程?；蛑饕c需氧呼吸和三羧酸循環(huán)有關(guān)。

5. 選取了與氧化還原過程相關(guān)的核心基因PAS_chr2-1_0582運(yùn)用同源重組進(jìn)行敲除驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)此基因敲除可抑制醇類的消耗，證明了此基因確實(shí)與氧化還原過程相關(guān)。

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