中南大學湘雅醫(yī)院范學工教授課題組通過高通量測序手段，對表達HBx基因的肝細胞中miRNA-mRNA之間的相互調(diào)控進行研究，研究成果發(fā)表于World Journal of Gastroenterology，烈冰在該工作中提供了高通量測序和生物信息分析服務及技術支持。

肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，俗稱“癌中之王”。據(jù)統(tǒng)計，每年有超過74.5萬的患者因HCC死亡，對其發(fā)病機制、診斷方法和治療手段的研究更是如火如荼[1,2]。流行病學調(diào)查表明，長期慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染是導致HCC的主要病因，這種情況在亞洲更為常見[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒X基因（Hepatitis B Virus X, HBx）在HBV相關HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，肝細胞中HBx基因的表達會導致細胞增殖、細胞信號轉(zhuǎn)導、蛋白降解及凋亡[4-9]，但具體的分子機制尚有待闡明。miRNA作為一類內(nèi)源性小分子RNA，參與基因表達、細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。已有研究表明有多個miRNA家族，例如miR-122、miR-125、miR-199等，與HBV相關HCC的發(fā)生密切相關[10]。

本篇文章以“Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles in HBx-expressing hepatic cells”為題發(fā)表于 World Journal of Gastroenterology雜志，研究團隊來自中南大學湘雅醫(yī)院范學工教授課題組，NovelBio在該工作中提供了高通量測序和生物信息分析服務及技術支持。該研究對轉(zhuǎn)染HBx基因的肝細胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）和miRNA測序（miRNA-Seq），并通過對測序數(shù)據(jù)的分析繪制了miRNA-mRNA核心調(diào)控網(wǎng)絡，為HBV相關HCC的分子機制研究提供了新的思路和研究靶點。

Methods

研究者建立了可穩(wěn)定表達HBx基因的人類肝臟細胞系L02，命名為L02/HBx，作為實驗組；以轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒的L02/pcDNA作為對照組，分別進行mRNA-Seq和miRNA-Seq，篩選出L02/HBx組中發(fā)生差異表達的mRNA和miRNA。之后借助GO分析和KEGG Pathway富集分析來評估候選分子標志物（Biomarker）的功能，并通過調(diào)控網(wǎng)絡圖的構(gòu)建分析差異miRNA和mRNA的相互作用關系。

分析思路

Results

差異基因表達譜分析

首先，研究者通過比較兩組細胞的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，在L02/HBx細胞中篩選出1243個差異表達的基因，其中742個基因表達上調(diào)，另外501個基因表達下調(diào)（Figure1A）。研究者接著分別對這兩組基因中上調(diào)和下調(diào)差異較顯著的20個基因做了聚類分析（Figure1B）。

Figure1A. L02/HBx和L02/pcDNA細胞的RNA-Seq整體差異基因表達譜

Figure1B. 差異較顯著的20個上調(diào)基因和20個下調(diào)基因

從這些差異基因中，研究者進一步鎖定了5個上調(diào)基因---GPR6、KLHL31、FOXC1、UGT1A7 和MAGEA4，以及4個下調(diào)基因---SLC22A14、PCOLCE、A2M和KIAA1522，這些差異基因分別參與了DNA復制、細胞周期、細胞增殖、細胞粘附、代謝進程、腫瘤轉(zhuǎn)化等信號通路。研究者通過qPCR對這9個候選基因的表達進行定量驗證，定量結(jié)果與測序結(jié)果完全一致（Figure1C, D）。

Figure1C. 候選差異基因的qPCR驗證

Figure1D. 測序結(jié)果與qPCR定量結(jié)果的相關性分析

GO/KEGG Pathway富集分析

為了闡明差異表達的基因與HBx相關HCC的發(fā)生發(fā)展的相關性，NovelBio團隊協(xié)助研究者對1243個差異基因進行了GO功能富集分析和KEGG Pathway富集分析（Figure2A，B）。

Figure2A.差異基因的GO功能富集分析

Figure2B.差異基因的KEGG Pathway富集分析

miRNA表達分析

完成對差異基因的分析之后，文章接著對miRNA的表達進行差異篩選。結(jié)果顯示，與L02/pcDNA細胞相比，L02/HBx細胞中6個miRNA表達發(fā)生下調(diào)，16個miRNA表達上調(diào)（Figure3）。研究者對其中4個差異miRNA進行 qPCR表達量驗證，驗證結(jié)果與測序結(jié)果一致。

Figure3. L02/HBx細胞與L02/pcDNA細胞之間發(fā)生差異表達的miRNA

miRNA和mRNA表達譜整合分析

考慮到通過網(wǎng)絡圖鎖定核心miRNA群具有較高的預測準確度，研究者采用以下策略對L02/HBx細胞進行miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建（Figure4A）。

Figure4A. miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建策略

通過專業(yè)miRNA分析軟件miRnada和TargetScan，NovelBio團隊協(xié)助研究者成功預測出miRNA的潛在靶基因，然后結(jié)合靶基因群的表達模式（Figure1A），鎖定一系列顯著相關的miRNA-mRNA靶向關系。從這些關系中，研究者根據(jù)Degree值挑選出11個處于核心地位的miRNA，并繪制了miRNA-mRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡（Figure4B）。該網(wǎng)絡圖中，與miR340-5p形成靶向關系的基因數(shù)目最多，另外有幾個miRNA可通過組合的方式共同調(diào)控某些靶基因。

Figure4B. miRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡圖

為進一步縮小范圍，鎖定核心miRNA，研究者對這些靶基因進行了功能富集分析，挑選出其中與腫瘤信號通路（譬如DNA復制、基因表達、細胞周期、細胞分裂等）密切相關的基因，繪制核心miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡（Figure4C）。由該圖可以推測，L02/HBx細胞中發(fā)生上調(diào)的miRNA，如hsa-miR-7-5p和hsa-miR-182-5p，可能抑制了其靶基因MEF2C和GLI3的表達，從而促進了細胞的轉(zhuǎn)化；而L02/HBx細胞中發(fā)生下調(diào)的miRNA，包括hsa-miR-501-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-324-5p和hsa-miR-488-3p等，則由于表達量的降低減弱了對靶基因（如JAK1、MAPK1、STX3、BCL10等）的抑制效應，這些基因的激活可能會在HBx相關HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的促進作用。

Figure4C. 核心miRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡圖

肝癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的復雜生物學過程，涉及一系列的基因和細胞因子，而miRNA參與的基因調(diào)控可能在其中發(fā)揮了關鍵作用。在該篇研究之前已有研究報道多個miRNA，譬如hsa-miR-338-3p和hsa-miR-29c等，與HBx相關HCC的發(fā)展密切相關[11]。但鮮少有研究者將視線聚焦到miRNA和mRNA之間的靶向調(diào)控和相互作用。該研究借助二代測序手段，結(jié)合深入的生物信息學分析，首次對相關miRNA和mRNA進行了整合分析，繪制了miRNA-mRNA核心調(diào)控網(wǎng)絡。此項研究成果不僅有望揭示HCC細胞中HBx蛋白誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機制，還為其臨床診斷和治療提供了有價值的診斷標志物和藥物靶點。

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參考文獻

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