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半月板在關(guān)節(jié)穩(wěn)定、減震、接觸力分布和關(guān)節(jié)潤滑等方面起著重要作用，其包含不同的細胞類型，主要包括軟骨細胞形態(tài)細胞和纖維細胞形態(tài)細胞。然而，半月板的細胞類型組成、分布和相應(yīng)的生物標志物，以及治療半月板退變的生物靶點仍不清楚。
2019年12月7日，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院廖威明教授課題組和張志奇教授課題組通過ScRNA-Seq詳細描繪半月板的細胞組成，鑒定出一種在半月板組織工程中具有應(yīng)用前景的祖細胞，并證明了半月板的退變機制。并且通過TGFβ1治療有效緩解半月板退變提出一種半月板退變的潛在治療策略。此次研究工作中的單細胞RNA測序?qū)嶒炁c數(shù)據(jù)分析由烈冰科技參與支持。該研究成果以“Single- cell RNA- seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration”為題發(fā)表于《Annals of the Rheumatic Diseases》（IF=14.299）期刊。
分析思路：
測序樣本信息：
健康半月板樣本、退變半月板樣本
測序平臺：
BD Rhapsody系統(tǒng)
測序數(shù)據(jù)量：
100G
研究結(jié)果：
1. ScRNA-Seq揭示健康人半月板的細胞組成類型
研究者首先對健康人的半月板組織進行ScRNA-Seq，對3639個細胞進行t-SNE分析，共分出7個亞群，其中包含兩個新發(fā)現(xiàn)的細胞亞群：
① 內(nèi)皮細胞(EC)；②軟骨細胞祖細胞 (CPC)；③調(diào)節(jié)性軟骨細胞(RegC)；④纖維軟骨細胞（FC)；⑤預(yù)肥大軟骨細胞(PreHTC)；⑥纖維軟骨細胞祖細胞(FCP)；⑦增殖纖維軟骨細胞(ProFC)。并進一步通過免疫組化來確定各細胞亞群的分布，F(xiàn)CP主要分布于半月板表面，RegC在半月板中部，EC存在于紅區(qū)血管周圍 ，而PreHTC分布于白區(qū)。
圖1 健康人半月板的單細胞圖譜
2.健康人半月板細胞的分化軌跡分析
研究者通過擬時序分析發(fā)現(xiàn)FCP和EC存在于分化軌跡的起始處。為了進一步探究FCP是否具有祖細胞的性質(zhì)，根據(jù)高表達基因分選出CD146+原代半月板細胞，并對其進行分化和克隆能力的驗證。通過集落形成和多向分化潛能分析實驗驗證CD146+細胞可以向成骨細胞和脂肪細胞分化并形成集落。提示在健康人半月板細胞中，FCP具有祖細胞的特性。
圖2 人半月板祖細胞的鑒定
為了研究FCP的分化軌跡，研究者選取了FCP、ProFC、FC、PreHTC和RegC重新構(gòu)建了一條新的分化軌跡（圖3A）。軌跡起始部位由FCP和ProFC組成，其后為PreHTC，而末端Fate 1為FC，末端Fate 2由RegC組成（圖3B）。進一步分析FCP向 Fate1和Fate2分化過程中各亞群細胞基因表達模式（圖3C、3D）。
為了確定細胞分化軌跡，研究者分析了各亞群細胞的差異表達基因及表達模式，并研究了體內(nèi)半月板發(fā)育過程，觀察1、2、3、4、8、26和52周小鼠半月板中marker基因的表達情況（圖3E）：COL1A1出生后表達逐漸增強，在4周時達到高峰，隨后表達量逐漸降低；MYLK在3周后，表達量顯著下降。體內(nèi)實驗的基因表達趨勢與測序分析得出的趨勢相一致，進一步驗證了FCP的分化軌跡。
圖3 FCP分化的單細胞軌跡分支點分析
3.健康人群半月板與退變半月板單細胞圖譜的對比分析
研究者首先通過觀察組織結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)退變半月板的膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂（圖4A）。然后對健康和退變半月板進行ScRNA-Seq分析（圖4B-E），發(fā)現(xiàn)退變半月板的各細胞亞群占比發(fā)生顯著變化，并發(fā)現(xiàn)三個新的亞群：(1)單核細胞來源的樹突狀細胞(MoDC)；(2)肥大軟骨細胞(HTC)；(3)退變半月板祖細胞(DegP)。
圖4 健康人半月板與退變半月板單細胞圖譜的對比分析
4. 單細胞分化軌跡提示DegP是半月板退變的關(guān)鍵因素
研究者通過集落形成和多向分化潛能分析實驗發(fā)現(xiàn)DegP（CD318+細胞）可以形成集落并向多種細胞分化，證明在退變半月板中，DegP具有祖細胞特性。因此，研究者重新選取FCP、ProFC、CPC和DegP四個亞群來構(gòu)建分化軌跡，軌跡起始端主要由FCP和ProFC組成，F(xiàn)ate 1和Fate 2分別由DegP和CPC組成（圖5A、5B）。
通過比對健康與退變半月板的命運分支點基因表達情況，發(fā)現(xiàn)在半月板的退變過程中，F(xiàn)CP向DegP的分化是異常的細胞狀態(tài)（圖5C、5D）。研究者對此采用免疫組化染色實驗證實DegP標記基因（GAS1、DNER）在半月板病變且細胞增殖的區(qū)域顯著高表達(圖5E)。
此外，研究者還利用IL-1β分別刺激健康和退變半月板細胞，得到相似的結(jié)果：CD146+細胞減少和CD318+細胞增加，提示促炎介質(zhì)IL-1β誘導(dǎo)DegP活化是半月板退變的機制。
圖5 單細胞分化軌跡提示DegP是半月板退變的關(guān)鍵因素
5. TGFβ信號通路的激活可以抑制退變半月板CD318+細胞的增加
由于TGFβ信號通路激活后會增強半月板干細胞的分化能力。研究者觀察到在健康半月板細胞中TGFβ信號通路被上調(diào)，而且其配體TGFβ1顯著高表達（圖6A-D）。因此，研究者利用TGFβ1體外刺激退變半月板細胞，發(fā)現(xiàn)CD318+細胞數(shù)量明顯減少、COL1A1（FCP標記基因）表達量增加（圖6E、6F），提示TGFβ可能有延緩半月板退變的作用。
圖6 TGFβ信號通路的激活可以抑制退變半月板Cd318+細胞的增加
綜上所述，研究者通過使用ScRNA-Seq全面描繪了健康及退變半月板細胞的圖譜，并確定了在半月板組織工程中具有重要意義的CD146+祖細胞。其次，研究者還證實了促炎介質(zhì)誘導(dǎo)DegP活化是半月板退變的可能機制，TGFβ可以減少DegP的比例，這可能成為延緩半月板退變的治療策略。
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