近日，《基因組蛋白質(zhì)組與生物信息學報》（Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 簡稱GPB）公布了2022年度“中國生物信息學十大進展”，針對肝臟腫瘤免疫微環(huán)境中的中性粒細胞的大隊列研究成果《Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity》上榜。

值得注意的是，該研究采用124例肝癌患者病例的160個樣本，8只小鼠的29個新鮮組織樣本，基于Drop-seq技術(shù)（10x Genomics平臺)進行了大隊列中性粒細胞在肝癌的免疫微環(huán)境亞型的異質(zhì)性研究。

這與我們大家探討過的基于單細胞測序技術(shù)如何有效捕獲中性粒細胞的問題不謀而合，雖然Drop-seq技術(shù)對中性粒細胞的捕獲提出了更高的要求，但如此大規(guī)模的應用該技術(shù)對中性粒細胞的研究，或許可以給大家一些參考。

01.實驗設(shè)計

        團隊采用肝癌患者160個樣本(124個病例），29個新鮮組織（8只小鼠），通過無抗體富集進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。此外，對84個配套病例進行了外顯子測序并收集了8個單細胞數(shù)據(jù)集、453個組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和10個空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進行了數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析。

        單細胞捕獲技術(shù)：Drop-seq

        單細胞捕獲平臺：10x Genomics

        單細胞數(shù)據(jù)分析工具：細胞聚類分析，subCluster分析，差異基因表達分析，GO/Pathway分析，基因集富集分析，公共數(shù)據(jù)（單細胞、轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組）聯(lián)合分析等

        主要技術(shù)手段：scRNA-seq、多色免疫熒光、ATAC-seq、外顯子測序等

02.分離中性粒細胞實驗方法

        中性粒細胞是一類“嬌滴滴”的細胞，通常在體內(nèi)進入外周血后存活不超過一周，體外存活不超過24小時。脆弱細胞更需要溫和的呵護，且先前的肝癌單細胞研究中均未報道過中性粒細胞的存在。

        本研究中，團隊也強調(diào)了中性粒細胞獲取的特殊性。針對樣本前處理環(huán)節(jié)，研究團隊對組織樣本保持最小的操作時間，僅采用MACS死細胞去除處理細胞懸液，將樣本前處理時間從手術(shù)后縮短（腫瘤和鄰近肝組織）到2h內(nèi)（包括PCR反轉(zhuǎn)錄的實驗過程），延長處理時間可能導致中性粒細胞捕獲失敗。

數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)，中性粒細胞UMI檢測范圍設(shè)置為100-6000，其他細胞群的UMI檢測范圍保持在500-6000，最終在基因CSF3R、S100A8和S100A9表達的基礎(chǔ)上，共鑒定出34307個中性粒細胞。

03.主要實驗結(jié)果解析

基于生信數(shù)據(jù)分析，團隊系統(tǒng)解析出89個細胞亞群，包括11個首次發(fā)現(xiàn)的中性粒細胞亞群，基于聚類分析，獲得了5種不同的免疫微環(huán)境亞型，包括免疫激活型；髓系富集免疫抑制型；基質(zhì)富集免疫抑制型；免疫排斥型和免疫駐留型。

        11個中性粒細胞亞群中，團隊成功鑒定出6群腫瘤相關(guān)中性粒細胞，分別富集在外周血、癌旁和腫瘤組織中。其中兩個中性粒細胞亞群CCL4+ TAN和PD-L1+ TAN可能促進了腫瘤的生長?；诩毎才囵B(yǎng)、轉(zhuǎn)錄組測序、ATAC-seq和多色免疫熒光等實驗，團隊發(fā)現(xiàn)CCL4+ TAN招募腫瘤相關(guān)巨噬細胞僅為促進腫瘤生長，而PD-L1+ TAN抑制了CD8+ T細胞的殺傷能力。

基于小鼠肝癌自發(fā)腫瘤模型，團隊利用Anti-Ly6G抗體進行治療，發(fā)現(xiàn)小鼠中性粒細胞去除后有效遏制了肝癌的生長，其骨髓、外周血、癌旁和腫瘤組織的中性粒細胞亞群的開始發(fā)生動態(tài)變化，中性粒細胞有望成為肝癌免疫治療的新靶點。

04.烈冰PanoCell^®單細胞服務(wù)方案有效應對中性粒細胞的單細胞測序研究

        結(jié)合烈冰既往測序服務(wù)經(jīng)驗和該文章發(fā)表情況，基于Cyto-seq的微孔捕獲技術(shù)依靠細胞在微孔中的重力沉降作用，捕獲過程比較溫和，無需其他通電加壓等強刺激操作，對此類敏感脆弱的細胞損傷可能較小，對實驗前處理操作要求的包容性也相對更高，更適合此類特殊項目的研究。烈冰自主研發(fā)PanoCell蜂巢板，采用微孔捕獲細胞技術(shù)，可有效獲得中性粒細胞。

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