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邦耀生物非病毒定點整合CAR-T技術（Quikin CART®）治療復發(fā)難治性淋巴瘤的臨床試驗結果表明：87.5%（7/8）的患者獲得疾病完全緩解，5例無癌生存已超過1年，首例接受治療的患者已無癌生存2年！
一代代的科學家和臨床學者的堅持探索和仁心仁術，讓每位罹患癌癥的患者不再畏懼寒冬，這也是烈冰全力幫助科學家攻關科研和臨床難題的意義和初心。
那么究竟是什么成果讓小編熱淚盈眶呢？
我們先從幾個故事講起：
01 腫瘤軍團和免疫軍團的戰(zhàn)爭從未停歇
人體本身的免疫軍團時刻保持警惕，幫助抵御外來病原體的入侵并及時發(fā)現(xiàn)和清除人體內“叛變”的細胞，對癌細胞同樣也是如此，但免疫細胞為防止自己“權柄遮天，濫殺無辜”，也給自己建立了一套“剎車系統(tǒng)”，保證執(zhí)行的消殺任務保持在正常范圍，不會“殺紅了眼”造成不必要的傷亡，因此剎車系統(tǒng)就需要不時來控制一下，也就是我們常說的免疫檢查點。 而腫瘤軍團也不是吃素的，它不僅會隱藏戰(zhàn)術，讓清除它的T細胞很難發(fā)現(xiàn)他，即使位置暴露后還會猛踩免疫細胞的剎車系統(tǒng)，讓T細胞不再追擊。
因此，自身免疫系統(tǒng)也亟需調整作戰(zhàn)思路，一舉殲滅腫瘤軍團：
① T細胞重新找出腫瘤細胞（CAR-T療法）；
② 不受阻礙全力追擊腫瘤細胞（免疫檢查點抑制劑）。
圖片來源：百家號
02 CAR-T制敵“新策略”
嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法是一種新型過繼免疫療法。它將患者T細胞在體外進行基因改造，使T細胞表達識別腫瘤特定抗原的單鏈抗體和T細胞活化的信號結構域，經(jīng)過體外擴增后回輸至患者體內，從而實現(xiàn)腫瘤的靶向殺傷。
圖片來源：搜狐號
但新療法依然存在一些問題亟待優(yōu)化，如現(xiàn)階段的CAR-T制備大都通過慢性病毒感染的方式實現(xiàn)，這種通過隨機整合的方式將CAR序列插入到T細胞基因組中和病毒DNA的引入也可能帶來療效的打折和潛在的安全隱患問題。
03 CRISPR/Cas9基因編輯技術加入戰(zhàn)場
CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物一種抵御外來入侵核酸的免疫系統(tǒng)，已被廣泛用于新藥開發(fā)、疾病治療、動物模型構建以及分子診斷等各領域的基因組編輯中。結合CRISPR/Cas9技術，讓CAR序列的隨機整合方式轉變?yōu)槎ㄏ蛘戏绞匠蔀榭赡?，已有多項研究利用該技術成功制備了定點整合型CAR-T細胞，那么如何解決使用病毒帶來的問題呢？
最好的辦法當然是，不用病毒，即非病毒的定點整合CAR-T！
但這在之前還只是個構想，還從未有研究團隊實現(xiàn)過~
04 夢想終將照進現(xiàn)實
2022年8月31日，烈冰生物合作伙伴華東師范大學生命科學學院張楫欽、劉明耀、杜冰、李大力團隊與浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院黃河、胡永仙團隊合作在國際著名科研期刊Nature（IF=69.504）上在線發(fā)表了題為Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL的研究論文，證明了開發(fā)的創(chuàng)新性非病毒定點整合CAR-T技術在治療復發(fā)難治性淋巴瘤的臨床試驗中具有出色的臨床安全性和有效性。另外值得一提的是，張楫欽、劉明耀、杜冰、李大力也是邦耀生物的核心管理團隊成員。
烈冰生物有幸參與了本研究中的單細胞測序工作，為研究團隊機制研究方面的工作提供了數(shù)據(jù)支持。
【關于該項研究思路及過程解析】
01非病毒定點整合CAR-T細胞的制備
首先，為提高大片段CAR序列在T細胞中的整合效率，團隊通過大量實驗摸索和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以同源臂長度為800bp的線性雙鏈DNA作為模板，可獲得最好的CAR-T整合效果，并利用AAVS1位點進一步制備了靶向CD19的定點整合型CAR-T細胞（AAVS1-19bbz）。與慢病毒感染CAR-T細胞（LV-19bbz）相比，盡管電穿孔過程會導致一些細胞損傷，但并不影響CAR-T細胞的增殖和高細胞活力，AAVS1-19bbz均能在體外和小鼠體內殺傷腫瘤細胞，證明了制備非病毒定點整合的CAR-T細胞的策略是可行的。
02非病毒PD1定點整合CAR-T細胞對腫瘤殺傷力
基于多項PD1敲除可以有效增強CAR-T細胞功能的前置研究，團隊將目光聚焦到開發(fā)非病毒PD1定點整合CAR-T細胞上來（PD1-19bbz），希望獲得增強型的非病毒定點整合CAR-T細胞。實驗發(fā)現(xiàn)在PD1位點，CAR序列的整合效率為20%左右（最高30.3%），且PD1-19bbz細胞的增殖能力要優(yōu)于LV-19bbz，PD1下調并不會影響CAR-T細胞行使腫瘤殺傷功能。
為了充分了解PD1-19bbz細胞的特性，團隊使用慢病毒和 CRISPR-Cas9技術制備了PD1敲除的 CAR-T 細胞。將其與LV-19bbz、AAVS1-19bbz和PD1-19bbz三組對比發(fā)現(xiàn)，PD1-19bbz的CAR表達水平與其他樣本組相似，但PD1-19bbz細胞對高表達或低表達 PD-L1的腫瘤細胞表現(xiàn)出更強大且持久的殺傷效果，小鼠生存率得到顯著提高，說明PD1敲除與非病毒定點整合CAR-T細胞制備方法可以聯(lián)合提高抗腫瘤功能。
03 臨床試驗評估該方案安全和有效
在此基礎上，研究團隊開展了研究者發(fā)起的臨床試驗以評估該方法治療復發(fā)難治性非霍奇金淋巴瘤（r/r B-NHL）的安全性和有效性：8例接受治療的患者中，未觀察到CAR-T治療相關的神經(jīng)毒性和2級以上的細胞因子風暴，其中7名患者（87.5%）在治療后的觀察期內實現(xiàn)了疾病的完全緩解（CR），有5名患者出現(xiàn)持久反應，PD1-19bbz 細胞在體內增殖并持續(xù)存在，所有患者的最佳客觀緩解率為100%。值得注意的是，PD1-19bbz在回輸劑量和陽性率較低的條件下也顯示出良好的療效，表明非病毒PD1整合的CAR-T細胞對r/r B-NHL具有很高的安全性和有效性。
04 單細胞測序為全面了解治療前后狀態(tài)的變化提供支持
為了進一步了解非病毒PD1整合的CAR-T細胞的特性，團隊利用不同方法制備了CAR-T細胞并進行了單細胞測序，對10個樣本（分組詳見下圖a）中獲得的63789個細胞進行了深入分析，通過CD8+記憶和功能障礙/細胞毒性marker gene將其分為2大類群，從記憶和功能障礙/細胞毒性基因表達情況來看，非病毒基因特異性靶向（PD1-19bbz、AAVS1-19bbz）的細胞中CD8+記憶細胞百分比更高。與AAVS1-19bbz細胞相比，PD1的敲除使PD1-19bbz細胞具有增強的免疫反應能力。
為探究PD1-19bbz細胞在回輸前后的特性，團隊進一步對3例患者不同治療時間節(jié)點的9個臨床樣本也進行了單細胞測序并獲得54774個細胞，數(shù)據(jù)分析結果顯示：回輸后CD8+CAR+細胞中記憶細胞相關基因持續(xù)表達(如SELL、CD27等），某些細胞功能障礙相關基因表達減弱（如ITGAE、CD38等），說明回輸后存續(xù)的CAR-T細胞傾向于維持記憶性細胞的狀態(tài)；此外，免疫反應相關的多個基因在預后好的患者樣本中富集；基因集富集分析 (GSEA) 表明，PD1低表達的CAR+細胞具有更高的增殖和免疫反應能力，這為全面了解PD1-19bbz回輸前后狀態(tài)的變化并解釋其臨床表現(xiàn)提供了數(shù)據(jù)支持。
【總結】
研究團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),在不使用病毒載體的情況下成功制備了靶向CD19的PD1下調定點整合型CAR-T細胞，并通過臨床試驗證明了其臨床治療的安全性和有效性。進一步結合單細胞測序技術，證實了非病毒PD1定點整合CAR-T細胞具有更高比例的記憶性T細胞和更強的免疫反應能力。本研究對推動CAR-T技術的發(fā)展具有重大意義。
單細胞捕獲平臺：烈冰生物10X Genomics平臺
生信數(shù)據(jù)分析平臺：NovelBrain®生信分析系統(tǒng)
數(shù)據(jù)分析工具：細胞聚類分析，Marker gene鑒定，GSEA分析，Qusage分析等
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05140-y
撰稿：烈冰市場部
文稿審核：原文作者團隊
排版：烈冰市場部