生活中發(fā)生腰痛很常見。隨著現(xiàn)代生活壓力增加，很多人不注意腰部保健。腰部損傷可以使椎間盤老化退變或小關節(jié)結構紊亂、椎間隙變窄等，其中髓核（NP）退變是導致椎間盤退行性變（IVDD）和腰痛的主要原因，但潛在的分子機制和細胞異質性尚不清楚。

本期，小編就來介紹一下蘇州大學第一附屬醫(yī)院鄒俊老師研究團隊（澳大利亞新南威爾士大學涂計博士，李文甜博士，澳大利亞昆士蘭大學楊思東博士，共同第一作者）發(fā)表在Advanced Science(IF=16.802)上的文章，題目為Single-Cell Transcriptome Profiling Reveals Multicellular Ecosystem of Nucleus Pulposus during Degeneration Progression。這篇文章利用單細胞測序等技術，揭示了髓核在椎間盤退行性變中的發(fā)生進程。

烈冰生物參與了本次單細胞測序實驗和數(shù)據(jù)分析工作，下面請跟隨小編的步伐，來看看這篇文章的研究思路和結果分析吧~

# 樣本信息 #

8個不同級別的IVDD患者的NP組織樣本，患者詳細信息如下：

# 主要技術手段 #

單細胞轉錄組測序，

實時熒光定量技術，免疫組化技術，免疫熒光技術，流式細胞分選術，細胞培養(yǎng)技術等。

# 捕獲平臺 #

BD Rhapsody

# 研究結果 #

1. 髓核細胞（NPCs）亞型鑒定及分析

首先，作者利用單細胞測序技術，從八名不同級別的IVDD患者中分別分離出NP組織，總共獲得39732個細胞。研究者利用marker gene判定分析，鑒定出6個主要的細胞亞型，分別為肥大軟骨細胞樣NPCs（HT-CLNPs），效應NPCs（effector NPCs），穩(wěn)態(tài)NPCs（homeostatic NPCs），監(jiān)管NPCs(regulatory NPCs)，纖維NPCs（fibroNPCs），粘附 NPCs（adhesion NPCs）。另外，Ⅱ級IVDD患者中主要是HT-CLNPs和regulatory NPCs，Ⅲ和Ⅳ級主要是HT-CLNPs和effector NPCs，Ⅴ級主要是fibroNPCs和adhesion NPCs。最后作者利用實時熒光技術和免疫組化技術進行了驗證，結果與單細胞分析數(shù)據(jù)一致。

2. IVDD患者的轉錄組差異

接下來作者分析了不同級別IVDD患者的轉錄本信息，鑒定出了一系列與退行性程度相關的轉錄因子（LMX1A、PRDM1、REL等）。隨后，作者利用差異表達基因分析，GO Pathway富集分析，發(fā)現(xiàn)了與IVDD發(fā)展級別相關的基因（HSPH1、CTGF、MMP13、HSP90AA1），在重度IVDD患者中熱休克蛋白基因（HSPA1B、HSPH1、HSP90AA1等）顯著上調，說明了stress-related機制在IVDD中的重要性。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了一系列可能會引起退行性發(fā)生的通路，包括抗原加工和呈遞通路、TNF通路、MAPK通路及Hippo通路等。

3. 細胞亞群的轉錄組特征

基于已有研究：神經支配，血管生成和細胞衰老與IVDD的發(fā)生相關。為了分析亞群之間的功能差異，作者利用GO富集分析，發(fā)現(xiàn)在血管生成方面，fibroNPCs占比最高。而后作者利用QuSAGE分析、SCENIC分析，發(fā)現(xiàn)regulatory NPCs中高表達的基因（CXCL3、IL-6和CHI3L1）參與了細胞炎癥和內源性刺激的反應，表明該細胞亞型可能具有調節(jié)免疫的功能；homeostatic NPCs中與細胞內平衡相關（翻譯調控和蛋白質/RNA代謝）的基因高表達；adhesion NPCs具有細胞遷移和細胞基質黏附作用；HT-CLNPs中與細胞周期阻滯和衰老相關的基因表達活躍，且鑒定了HT-CLNP-Ⅰ和HT-CLNP-Ⅱ，作者又利用擬時序分析揭示了HT-CLNP-Ⅰ和HT-CLNP-Ⅱ的演化進程。

4. fibroNPCs亞群的特征

接下來，作者研究了不同細胞亞群之間的關系并利用細胞軌跡重建分析揭示了細胞分化方向和細胞譜系軌跡。細胞間的分化順序為fibroNPCs、adhesion NPCs、effector NPCs、regulatory NPCs、HT-CLNP和homeostatic NPCs。另外，研究者利用scVelo軌跡分析發(fā)現(xiàn)，fibroNPCs具有分化成其他亞型細胞的潛力，是主要的終末期髓核細胞，表明fibroNPCs具有干細胞特性。進一步，基于細胞亞群劃分和基因表達情況，作者發(fā)現(xiàn)CD90在fibroNPCs中特異性表達，推測CD90+NPCs是fibroNPCs的主要干細胞群體。最后，作者利用實時熒光技術，細胞培養(yǎng)技術，染色技術，免疫熒光技術等驗證了fibroNPCs可促使NP退變。

5. NP衍生的G-MDSCs亞群的鑒定

在NP中除了有髓核細胞外，還有免疫細胞，作者共鑒定出了9種類型免疫細胞，包括單核細胞和巨噬細胞（marker為CD163），中性粒細胞（marker為FCGR3B (CD16b) 和 HLADR），GMPs細胞（marker為MS4A3, MPO, ELANE），NK細胞（marker為CD94），粒細胞性髓系源性抑制細胞（G-MDSCs　marker為ITGAM(CD11b), OLR1, ARG1）等。而后作者利用擬時序分析，預測了免疫細胞的分化方向是從GMPs，G-MDSCs到中性粒細胞。進一步，作者通過流式分選技術分離出CD45+CD11b+OLR1+ CD24+/-的G-MDSCs，發(fā)現(xiàn)輕度退行性NP組織中的G-MDSCs約是重度的3倍。在大鼠模型中利用免疫組化和免疫熒光進行驗證，也發(fā)現(xiàn)G-MDSCs在重度模型中的減少。

6. NP衍生的G-MDSCs功能驗證

基于上述研究結論，作者推測G-MDSCs細胞在IVDD病程發(fā)展中至關重要。隨后，作者通過流式分選技術分離出CD45+CD11b+OLR1+CD24+/-的兩群G-MDSCs，利用免疫抑制實驗和活性氧（ROS）檢測技術及細胞共培養(yǎng)等技術，對G-MDSCs的進行功能驗證，結果發(fā)現(xiàn)G-MDSCs具有免疫抑制細胞和ROS產生的能力，其中CD24+的免疫抑制能力和ROS產生更強。另外有研究表明白細胞介素（IL-1β）可誘導髓核NP退行性發(fā)生。作者將G-MDSCs與NPCs共培養(yǎng)（加入IL-1β），發(fā)現(xiàn)聚集蛋白聚糖（髓核中主要的蛋白多糖）有所增加，而與退行性進程相關的基因（MMP13）表達下降，這表明G-MDSCs可緩解IL-1β介導的NPCs的退變。

7. IVDD中細胞間相互作用

最后，作者利用細胞通訊分析探究了細胞間的相互作用，結果發(fā)現(xiàn)巨噬細胞與其他類型細胞的相互作用最多，而NPCs間的相互作用最為活躍。對免疫細胞與退行性NPCs間的通訊網絡預測發(fā)現(xiàn)，NPCs上的受體（FN1，F(xiàn)GF）與免疫調節(jié)相關的細胞因子（TNF, IL-6, PDGF, TGFB等）存在相互作用。以上結果表明免疫細胞和NPCs在NP中的發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，例如炎癥平衡，細胞增殖和血管生成等。

結論

本研究中作者利用單細胞測序等技術，共鑒定了NPCs的6種細胞亞型，在分析各個亞型的潛在功能時，作者發(fā)現(xiàn)fibroNPCs（marker gene：CD90）是退行性NP組織中的干細胞，另外粒細胞G-MDSCs具有緩解椎間盤退行性發(fā)展的潛能?？傊?，該研究中揭示了NP的多種NPCs亞型的特征，為IVDD治療提供了新思路。

原文鏈接

https://doi.org/10.1002/advs.202103631