骨折是最常見的骨創(chuàng)傷疾病，其愈合由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同作用調(diào)節(jié)。已有研究表明B細(xì)胞影響了破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化，但是由于骨折愈合過程中骨髓微環(huán)境的復(fù)雜性，B細(xì)胞在骨折愈合中的作用機(jī)制尚不清楚。

今天小編為大家?guī)砹艘黄傻诙娽t(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院紀(jì)方教授團(tuán)隊(duì)在Frontiers in Endocrinology（IF=5.555）發(fā)表的題為“Single-Cell RNA Sequencing Reveals B Cells Are Important Regulators in Fracture Healing”的文章，揭示了B細(xì)胞在骨折愈合過程中發(fā)揮的重要作用，對(duì)骨折等骨疾病治療策略具有重要意義。

烈冰生物參與了本次單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)和數(shù)據(jù)分析工作，下面請(qǐng)跟隨小編的步伐，來看看這篇文章的研究思路和結(jié)果分析吧~

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樣本信息

1例（＜5 d）骨折組織

1例（＞30d ）骨折組織

小鼠骨折組織（0、3、7、14d）

技術(shù)手段

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

免疫熒光、免疫印跡、TRAP染色

捕獲平臺(tái)

BD Rhapsody

研究結(jié)果

1、骨折組織的單細(xì)胞圖譜分析

研究者總共對(duì)9339個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，通過細(xì)胞聚類分析和鑒定，獲得了13種細(xì)胞類群，包括6個(gè)中性粒細(xì)胞群、2個(gè)早期紅細(xì)胞群、2個(gè)T細(xì)胞群、1個(gè)B細(xì)胞群、1個(gè)漿細(xì)胞群和1個(gè)單核細(xì)胞群。另外對(duì)比新、舊骨折組織的細(xì)胞群發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞在數(shù)量上存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。

圖1 人新、舊骨折組織單細(xì)胞圖譜

2、骨折組織的B細(xì)胞鑒定

為了探究B細(xì)胞在骨折愈合中的作用，研究者利用subCluster分析，將B細(xì)胞定義為5個(gè)細(xì)胞亞群（圖2）：pDC細(xì)胞（表達(dá)CLEC4C），pro-B細(xì)胞（表達(dá)HLA-DRA和CD74），成熟B細(xì)胞（表達(dá)CD23和CD24）和漿細(xì)胞（包括P1和P2，表達(dá)J-chain）。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)（表1），相較于新骨折組織（Control組），骨折30天的組織（Case組）B細(xì)胞數(shù)量顯著減少，擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)Case組各時(shí)期B細(xì)胞構(gòu)成與對(duì)照組相似，在血腫形成階段，所有B細(xì)胞亞群均減少，提示了B細(xì)胞可能影響了骨折愈合過程。

圖2 人骨折組織B細(xì)胞分群分析

表1 新、舊骨折組織不同免疫細(xì)胞類型數(shù)量占比

3、小鼠骨折模型中B細(xì)胞的研究

進(jìn)一步，研究者建立了小鼠骨折模型（圖3），分別在0、3、7、14d采集小鼠骨折組織細(xì)胞，獲得6個(gè)B細(xì)胞亞群：T2B、T1B、B1、B2、B1b1和B1b2。通過擬時(shí)序、細(xì)胞通訊、GO富集分析和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在骨痂形成過程中，B細(xì)胞的減少促進(jìn)了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化，而在骨痂愈合過程中，B細(xì)胞的增加抑制了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化（圖4），即B細(xì)胞在骨折愈合過程中發(fā)揮了重要作用。

圖3 小鼠骨折模型

圖4 小鼠骨折模型中B細(xì)胞的作用

4、B細(xì)胞外泌體體外和體內(nèi)作用

研究者進(jìn)一步通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與B細(xì)胞共培養(yǎng)后，破骨細(xì)胞分化增加，成骨細(xì)胞分化減少。后經(jīng)過免疫印跡、RT-qPCR等實(shí)驗(yàn)（圖5），證實(shí)了B細(xì)胞外泌體在體外抑制成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。

圖5 B細(xì)胞外泌體體外實(shí)驗(yàn)

最后研究者將B細(xì)胞外泌體注射到小鼠體內(nèi)連續(xù)8周，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠的骨小梁體積、數(shù)量和厚度顯著低于對(duì)照組，骨小梁間距顯著高于對(duì)照組（圖6）。

圖6 B細(xì)胞外泌體體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

結(jié)論

綜上所述，文章通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)，解析了在骨折愈合不同階段，骨髓微環(huán)境中免疫細(xì)胞類型的變化，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞在骨折愈合過程中的重要作用。另外，B細(xì)胞外泌體可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化，為B細(xì)胞外泌體研發(fā)治療骨折或骨質(zhì)疏松等疾病的納米藥物提供新的思路。

原文鏈接

https://doi.org/10.3389/fendo.2021.666140