號(hào)外號(hào)外！前列腺癌Nature子刊發(fā)文后續(xù)，針對(duì)免疫療法對(duì)前列腺癌治療效果差的問(wèn)題，上海長(zhǎng)征醫(yī)院任善成教授團(tuán)隊(duì)應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序持續(xù)發(fā)力，挖掘前列腺癌免疫療法的重要靶點(diǎn)。

繼NCB文章發(fā)表研究進(jìn)展后，2021年11月，任善成教授團(tuán)隊(duì)再次于國(guó)際權(quán)威期刊Clinical Cancer Research（IF=12.53）上，發(fā)表前列腺癌免疫治療的前沿研究性論文——“Single-cell analysis reveals EP4 as a target for restoring T cell infiltration and sensitizing prostate cancer to immunotherapy”。這篇文章主要內(nèi)容是利用單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)揭示了EP4（PTGER4）作為恢復(fù)T細(xì)胞浸潤(rùn)和使前列腺癌敏感的靶標(biāo)。

烈冰生物有幸參與本研究中的單細(xì)胞測(cè)序和數(shù)據(jù)分析工作，下面我們一起了解一下本論文的研究思路和數(shù)據(jù)分析過(guò)程吧~

樣本信息

樣本收集：

13個(gè)原發(fā)前列腺癌PCa樣本（10X Genomics平臺(tái)）

4個(gè)去勢(shì)性前列腺癌CPRC樣本（BD Rhapsody平臺(tái)）

單細(xì)胞捕獲平臺(tái)：10X Genomics、BD Rhapsody

技術(shù)手段

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

流式細(xì)胞分選

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

普通轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

藥物治療模型

細(xì)胞趨化因子分析技術(shù)

單細(xì)胞分析工具應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)化主成分分析

細(xì)胞類型鑒定

subCluster分析

差異基因表達(dá)分析

擬時(shí)序分析

接下來(lái)，小編將從以下6個(gè)方面為大家詳細(xì)介紹一下這篇文章中的主要研究成果。

結(jié)果分析

1.EP4(PTGER4)作為耗竭型T細(xì)胞的marker gene

為了研究EP4在T細(xì)胞介導(dǎo)的前列腺癌（PCa）免疫中的作用，作者對(duì)13個(gè)原發(fā)PCa患者和4個(gè)CRPC患者的癌組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序研究。通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類分析，分別利用UMAP進(jìn)行可視化展示，結(jié)果如下圖1.1A。

圖1.1 原發(fā)PCa和CRPC的細(xì)胞類型鑒定

對(duì)CD8⁺ T細(xì)胞進(jìn)行擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)PCa患者的CD8⁺ T細(xì)胞有兩個(gè)分化方向，基于擬時(shí)序的BEAM（Branch Expression Analysis modeling）分析，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞向耗竭轉(zhuǎn)化過(guò)程中，EP4基因表達(dá)顯著上升。同樣在CRPC患者中，也觀察到了這個(gè)現(xiàn)象。研究者隨后在泛癌（pan-cancer）表達(dá)譜數(shù)據(jù)水平上進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌中的耗竭型T細(xì)胞中也同時(shí)高表達(dá)EP4，即EP4可能是耗竭型T細(xì)胞的marker gene。進(jìn)一步，作者利用Changhai，TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)的前列腺癌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定了EP4是前列腺癌耗竭型T細(xì)胞的基因標(biāo)記。

圖1.2 EP4作為耗竭型T細(xì)胞的marker gene的特征

2.EP4的高表達(dá)表明免疫抑制微環(huán)境的存在

為進(jìn)一步探究EP4在前列腺腫瘤免疫微環(huán)境（TME）中的作用，研究者對(duì)TAMs（腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞）和中性粒細(xì)胞的數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬時(shí)序分析和差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性PCa的TAMs有兩個(gè)M2的抑制免疫的分化方向(圖2A，B)。在CRPC樣本中，鑒于BD Rhapsody平臺(tái)可以無(wú)偏的對(duì)中性粒細(xì)胞進(jìn)行功能分析，采用該平臺(tái)鑒定出6個(gè)中性粒細(xì)胞亞群和2個(gè)多態(tài)核髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞亞群（PMN-MDSCs， marker為L(zhǎng)OX-1）。進(jìn)一步，使用流式細(xì)胞術(shù)分選出LOX-1陽(yáng)性的細(xì)胞，并與T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)PMN-MDSCs抑制了T細(xì)胞增殖并降低了細(xì)胞毒性。擬時(shí)序BEAM分析發(fā)現(xiàn)，EP4表達(dá)量不同可影響PMN-MDSCs的分化趨勢(shì)；GSEA分析發(fā)現(xiàn)，EP4的高表達(dá)可顯著改變了白細(xì)胞偏移和趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路，表明PMN-MDSC參與免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)，而這也通過(guò)流式細(xì)胞分析中驗(yàn)證了該結(jié)論。

圖2 EP4作為免疫抑制因子在前列腺癌免疫微環(huán)境中的作用

3.EP4拮抗劑（YY001）調(diào)節(jié)TME中T細(xì)胞和MDSCs的功能和浸潤(rùn)

已有研究發(fā)現(xiàn)PGE2可誘導(dǎo)EP4表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)PMN-MDSCs的發(fā)育成熟，研究團(tuán)隊(duì)自主開發(fā)了一種小分子藥物YY001（EP4特異性的拮抗劑），利用YY001治療并通過(guò)FASC流式細(xì)胞分選和免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)YY001能逆轉(zhuǎn)PGE2對(duì)IFN-γ的抑制作用，其效果與另一種EP4拮抗劑（E7046）相似(圖3A)。此外，YY001可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖(分化為na?ve T和中央記憶T細(xì)胞)。在腫瘤細(xì)胞中，YY001治療顯著逆轉(zhuǎn)了PGE2誘導(dǎo)MDSC向TME的趨性。作者推測(cè)EP4拮抗劑和PD-1免疫治療聯(lián)合使用對(duì)PCa有較好的抑制作用(圖3）。

圖3 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究YY001的功能

4.YY001與抗PD-1抗體協(xié)同抑制PCa

基于先前研究，作者通過(guò)EP4拮抗藥物和抗PD-1抗體聯(lián)合用藥治療PCa，發(fā)現(xiàn)治療效果要好于單獨(dú)使用E7046（圖4A）；流式檢測(cè)顯示PD-1可抑制MDSCs的浸潤(rùn)但不增加CD8⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)；與YY001聯(lián)合用藥后，MDSCs的浸潤(rùn)程度明顯減少(圖4C和4E)、CD8⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加(圖4D和4F)，對(duì)腫瘤組織中MDSCs和CD8⁺ T細(xì)胞也得出了同樣的結(jié)論(圖4G和4H)，即聯(lián)合用藥下，浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞被極大地激活，導(dǎo)致殺傷腫瘤的TNF-γ以及IFN-α分泌增加(圖4I），削弱了MDSCs的免疫抑制功能，減少了MDSCs的浸潤(rùn)(圖4J-L)。

圖4 YY001與抗PD-1抗體協(xié)同抑制PCa

5.聯(lián)合治療緩解前列腺腫瘤細(xì)胞的免疫抑制作用

為了進(jìn)一步評(píng)估單獨(dú)使用YY001或結(jié)合PD-1抗體的療效，作者開發(fā)了一個(gè)15抗體PFC（多色流式細(xì)胞術(shù)）的panel，發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤樣本中可為癌細(xì)胞（CD45^-）和白細(xì)胞（CD45⁺）兩大類，與未治療組相比，用藥組白細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖5A），MDSCs細(xì)胞的數(shù)量減少，聯(lián)合治療后的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTLs）增加的數(shù)量明顯多余單獨(dú)用藥（圖5B,C）。且用藥后出現(xiàn)了自然殺傷細(xì)胞群體（圖5D），表明YY001與PD-1抗體的聯(lián)合治療可引起殺傷腫瘤效應(yīng)變化。此外，定量免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療后CD8⁺ T細(xì)胞數(shù)量增加（圖5E），即聯(lián)合用藥可促進(jìn)腫瘤免疫微環(huán)境的形成，增強(qiáng)CD8⁺ T對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。

圖5 聯(lián)合治療緩解免疫抑制

6.聯(lián)合治療可抑制腫瘤生長(zhǎng)

在動(dòng)物模型中，研究者利用CD8拮抗劑阻斷CD8⁺ T細(xì)胞作用后，發(fā)現(xiàn)YY001單獨(dú)用藥或聯(lián)合PD-1抗體治療均抑制了腫瘤的發(fā)展（圖6A-C）。另外，CD8的阻斷不影響粒細(xì)胞浸潤(rùn)，但影響了CD8⁺ CTLs細(xì)胞活性（圖6D-F），這表明CD8⁺ CTLs在治療前列腺癌中的關(guān)鍵作用。

最后作者使用了3種小鼠模型（Orthotopic, Rechallenged, humanized）驗(yàn)證了YY001與抗PD-1抗體聯(lián)合用藥的治療效果，發(fā)現(xiàn)在Orthotopic小鼠模型中，聯(lián)合用藥幾乎抑制了腫瘤的發(fā)生，模型小鼠存活率達(dá)100%；Rechallenged小鼠模型中，聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)且延長(zhǎng)小鼠壽命；Humanized小鼠模型中，聯(lián)合用藥療效要優(yōu)于單一治療，流式驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)YY001和抗PD-1抗體的聯(lián)合治療顯著增加了CD45⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)和CD8細(xì)胞數(shù)量。以上結(jié)果說(shuō)明YY001聯(lián)合抗PD-1抗體對(duì)前列腺癌的治療效果顯著。

圖6 各種前列腺癌模型中聯(lián)合治療可抑制腫瘤生長(zhǎng)并提高生存率

總結(jié)：

本研究應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)，全面探索了前列腺腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)EP4作為一個(gè)marker gene在前列腺腫瘤和多種免疫細(xì)胞中特異性表達(dá)。另外，研究者自主開發(fā)的新型藥物YY001可同時(shí)作用于腫瘤細(xì)胞和周圍的免疫細(xì)胞，一舉解決“識(shí)別”和“清除”兩大難題，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用。YY001與抗PD-1抗體聯(lián)合用藥，可顯著增強(qiáng)前列腺腫瘤免疫治療的療效，為前列腺腫瘤治療提供了新的方案。

原文鏈接

https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-21-0299

THE END

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