眾所周知，科研人的每一步都是在刀尖上舞蹈，任何一個(gè)成功的protocol背后，或許都有無數(shù)個(gè)“爆肝”的夜晚和經(jīng)驗(yàn)累積，尤其是針對(duì)植物單細(xì)胞領(lǐng)域，大家都還在“摸著石頭過河”的階段，上期植物領(lǐng)域干貨分享，我們聊到了植物組織單細(xì)胞測(cè)序的現(xiàn)狀和技術(shù)壁壘（詳情戳這里），大多數(shù)研究是先獲取原生質(zhì)體后再行捕獲單細(xì)胞進(jìn)而測(cè)序，但原生質(zhì)體的制備過程較為復(fù)雜，制備方法的專一性較強(qiáng)，在不同物種間難以直接遷移制備過程，甚至可能存在“彼之蜜糖，汝之砒霜”的效果。
因此這段時(shí)間，小編廣羅各大科學(xué)網(wǎng)站，挖到幾篇基于細(xì)胞核制備的植物單細(xì)胞測(cè)序的文章，獨(dú)樂樂不如眾樂樂，本篇先和大家介紹一種能夠從楊樹單個(gè)細(xì)胞核而不是整個(gè)細(xì)胞中表征mRNA的方法，幫助大家減少因制備原生質(zhì)體而帶來的問題。
實(shí)驗(yàn)材料：
楊樹梢尖（Populus tremula × alba INRA clone 717 1B4）和楊樹莖（nisquly -1），兩種材料均具有不同程度的細(xì)胞復(fù)雜性和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。
試劑
10牛血清白蛋白封閉液、RNase 抑制劑、鹽酸精胺、亞精胺、DTT、4X 細(xì)胞核分離緩沖液（40 mM MES-KOH pH 5.7, 40 mM NaCl, 40 mM KCl, 12mM MgCl2, 10 mM EDTA, 1M sucrose）、細(xì)胞核分離洗脫緩沖液（40 mM MES-KOH pH 5.7, 40 mM NaCl, 40 mM KCl, 12 mM MgCl2, 1M sucrose）
耗材
鑷子、無菌刀片、玻璃平板、移液槍、40uM濾網(wǎng)、5ml帶帽試管、50ml離心管、1.5ml RNase-free低吸附管
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
低溫離心機(jī)、 恒溫?fù)u床、細(xì)胞分選儀等
詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟解析
制核效果驗(yàn)證
如上操作方法盡量減少了葉綠體等細(xì)胞器的污染和可能堵塞微流控芯片的細(xì)胞碎片，從制核結(jié)果來看，研究者獲得了40000個(gè)DAPI+核（總回收體積67-70μl），可用于后續(xù)單細(xì)胞核測(cè)序?qū)嶒?yàn)。
基于10x Genomics平臺(tái)的細(xì)胞核捕獲及數(shù)據(jù)分析結(jié)果，測(cè)序數(shù)據(jù)基本飽和的情況下，Mean Reads per Nucleus在43000左右，mapping率＞73%，楊樹莖組織的2個(gè)重復(fù)顯示了表達(dá)基因之間的高度共性。
楊樹組織細(xì)胞核制備注意事項(xiàng)
1、 細(xì)胞核分離開始前，需將實(shí)驗(yàn)中所用的所有溶液、無菌刀片、各個(gè)規(guī)格的離心管、移液管等所需工具放置于0-4℃預(yù)冷至少30分鐘，并在實(shí)驗(yàn)過程中保持低溫狀態(tài)（置于冰上）。
2、 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需在冷室低溫環(huán)境下操作，以減少RNA降解。
3、 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程從植物材料收集到最終的分選，應(yīng)在90分鐘內(nèi)完成，以減少RNA污染和降解。
4、 制作組織勻漿時(shí)，應(yīng)保證所有植物材料必須與含有RNA降解抑制劑的緩沖液接觸。由于在樣品制備的這一階段可能會(huì)發(fā)生RNA降解，因此可以事后進(jìn)行RNA提取和質(zhì)量評(píng)估以驗(yàn)證其完整性。
5、 離心、洗脫、轉(zhuǎn)移勻漿等步驟操作均在冰上進(jìn)行。
參考文獻(xiàn)
A robust method of nuclei isolation for singlecell RNA sequencing of solid tissues from the plant genus Populus. PLoS One 2021 May 11;16(5):e0251149
