癌癥的特征之一是逃避免疫系統(tǒng)殺傷，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中一種常見的內(nèi)源性修飾。研究表明，m6A甲基化在逃避免疫系統(tǒng)破壞中具有重要功能。YTHDF1是一種多功能、強(qiáng)大的m6A reader，近年來(lái)在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)，但YTHDF1對(duì)免疫逃逸的影響還知之甚少。

近日，烈冰合作伙伴上海質(zhì)子重離子醫(yī)院孔琳教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF=17.694）上發(fā)表了題為“Tumor-intrinsic YTHDF1 drives immune evasion and resistance to immune checkpoint inhibitors via promoting MHC-I degradation”的論著。該研究通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)（scRNA-seq）揭示了腫瘤固有的YTHDF1驅(qū)動(dòng)免疫逃逸和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）抵抗，YTHDF1缺失促使免疫系統(tǒng)恢復(fù)監(jiān)測(cè)。

烈冰生物承擔(dān)了本研究中的單細(xì)胞測(cè)序和數(shù)據(jù)分析工作，下面跟隨小編的步伐，一起來(lái)看看本文的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究成果吧~

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：Ythdf1-KO腫瘤（n = 3），WT腫瘤（n = 3）

主要技術(shù)手段：CRISPR/Cas9基因編輯、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、單細(xì)胞測(cè)序、TMT蛋白質(zhì)組、免疫組化、免疫熒光檢驗(yàn)法、免疫沉淀（eCLIP）、Western blot等

捕獲細(xì)胞數(shù)：29325個(gè)CD45⁺免疫細(xì)胞

單細(xì)胞捕獲平臺(tái)：烈冰生物10x Genomics平臺(tái)

單細(xì)胞分析工具應(yīng)用：烈冰生物NovelBrain^®云平臺(tái)：細(xì)胞聚類、GO分析、Pathway分析、擬時(shí)序分析等

研究結(jié)果解析

01 YTHDF1與ICI耐藥性相關(guān)

基于TCGA-皮膚黑色素瘤（SKCM）數(shù)據(jù)集進(jìn)行免疫評(píng)分，作者發(fā)現(xiàn)在m6A調(diào)控因子中，YTHDF1 RNA與免疫評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，提示其可能在調(diào)節(jié)免疫逃逸中發(fā)揮作用。單樣本基因集富集分析表明，腫瘤固有YTHDF1呈現(xiàn)“免疫荒漠”表型。此外，對(duì)ICI治療具有耐藥性的黑色素瘤B16/F10細(xì)胞系中，YTHDF1表達(dá)顯著上調(diào)。通過(guò)分析現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，YTHDF1的高表達(dá)與ICI治療的耐藥性有關(guān)，與其他m6A reader相比，YTHDF1發(fā)揮了更重要的作用。

圖1 YTHDF1與“免疫荒漠”表型和ICI耐藥性相關(guān)

圖2 YTHDF1缺失抑制正常小鼠的腫瘤生成

03 Ythdf1-KO和WT小鼠腫瘤的免疫景觀

       為了進(jìn)一步揭示免疫微環(huán)境的異質(zhì)性，作者進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Ythdf1-KO和WT腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D45⁺免疫細(xì)胞），獲得了22個(gè)細(xì)胞亞群并進(jìn)一步劃分為10種免疫細(xì)胞群體。其中T細(xì)胞、NK細(xì)胞和增殖混合免疫細(xì)胞在Ythdf1-KO腫瘤中富集，而中性粒細(xì)胞和B細(xì)胞在WT腫瘤中浸潤(rùn)程度更高。細(xì)胞類型和占比在KO組和WT組之間表現(xiàn)出明顯的差異。

圖3 Ythdf1-KO和WT小鼠腫瘤的免疫微環(huán)境

       深入研究發(fā)現(xiàn)，在CD4⁺ T細(xì)胞進(jìn)一步可細(xì)分為naive CD4⁺ T細(xì)胞、effector memory CD4⁺ T細(xì)胞（CD4⁺ TEMs）、regulatory CD4⁺ T細(xì)胞（Tregs）、proliferating CD4⁺ T細(xì)胞和IFN-responsive CD4⁺ T細(xì)胞。其中KO組中naive CD4⁺ T細(xì)胞只占6%，而CD4⁺ TEMs，Tregs等相較于WT組明顯增加。KEGG和GO富集結(jié)果均顯示，一系列免疫相關(guān)通路（如：抗原加工和呈遞、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等）在CD4⁺ TEMs、proliferating CD4⁺ T細(xì)胞中上調(diào)。綜上，KO組中proliferating CD4⁺ T細(xì)胞和CD4⁺ TEMs亞型的免疫功能強(qiáng)于WT組。

圖4 CD4⁺ T細(xì)胞分析結(jié)果

        CD8⁺ T細(xì)胞可進(jìn)一步細(xì)分為4種T細(xì)胞亞型，其中KO組腫瘤表現(xiàn)出更多的CD8⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，KO組腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8⁺ T細(xì)胞比WT組具有更強(qiáng)的體外殺傷能力。而大量中性粒細(xì)胞（特別是腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞）多浸潤(rùn)在WT腫瘤中。如上結(jié)果說(shuō)明腫瘤固有YTHDF1缺失促進(jìn)了抗腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，并通過(guò)重新構(gòu)建TME來(lái)減少促腫瘤免疫細(xì)胞。

圖5 CD8⁺ T細(xì)胞分析結(jié)果

04 YTHDF1缺失增強(qiáng)了ICI治療效果

       通過(guò)比較WT組和KO組之間的免疫檢查點(diǎn)分子發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，YTHDF1缺失會(huì)增加PD-L1蛋白在體內(nèi)的表達(dá)，而抗PD-L1或抗CTLA-4抗體治療可以顯著減小Ythdf1-KO組的腫瘤體積。其中87.5%的抗CTLA-4和75%抗PD-L1治療的小鼠表現(xiàn)出了腫瘤完全排斥并實(shí)現(xiàn)無(wú)瘤生存。YTHDF1缺失將冷腫瘤轉(zhuǎn)化為熱腫瘤，其與ICI協(xié)同治療顯著延長(zhǎng)總生存期；攜帶Ythdf1-KO細(xì)胞、并被ICI治愈的小鼠可以抵抗WT腫瘤的再次攻擊，這表明這種聯(lián)合療法可以引發(fā)有效、持久的免疫記憶，避免腫瘤復(fù)發(fā)。

圖6 YTHDF1缺失會(huì)增強(qiáng)ICI治療效果

       結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，YTHDF1缺失抑制了溶酶體基因的翻譯過(guò)程，并限制了MHC-I和抗原的溶酶體蛋白水解，最終增強(qiáng)了免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的識(shí)別能力，恢復(fù)腫瘤免疫監(jiān)測(cè)。

圖7 YTHDF1促進(jìn)MHC-I水解

圖8 外泌體介導(dǎo)的YTHDF1缺失通過(guò)恢復(fù)體內(nèi)抗腫瘤免疫來(lái)延緩腫瘤生成

全文總結(jié)

綜上，本研究闡明了腫瘤固有YTHDF1在驅(qū)動(dòng)免疫逃逸中的作用及其潛在機(jī)制。YTHDF1缺失可增強(qiáng)CD8⁺和CD4⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)來(lái)改變TME的組成，同時(shí)也會(huì)限制MHC-I和抗原的水解，最終恢復(fù)腫瘤免疫監(jiān)測(cè)，并引發(fā)了強(qiáng)大的抗腫瘤免疫。此外，該研究開發(fā)了一種外泌體誘導(dǎo)的CRISPR/Cas9傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)可消耗YTHDF1并恢復(fù)腫瘤免疫監(jiān)測(cè)，為抑制和治療腫瘤細(xì)胞提供新的研究思路。

圖9 YTHDF1驅(qū)動(dòng)免疫逃逸的機(jī)制

上海質(zhì)子重離子醫(yī)院孔琳教授為本文的通訊作者，上海質(zhì)子重離子醫(yī)院林萬(wàn)尊為本文第一作者。

本研究詳細(xì)信息參見原文鏈接：10.1038/s41467-022-35710-7