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Whole Transcriptome Sequencing
全轉(zhuǎn)錄組是指特定細(xì)胞在特定狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA（non-coding RNA）。針對非編碼RNA的研究主要集中在具有調(diào)控作用的miRNA，lncRNA和circRNA。基于二代測序技術(shù)的全轉(zhuǎn)錄組測序研究，同時分析同一樣本中的mRNA，lncRNA，circRNA，miRNA，并且通過兩兩關(guān)聯(lián)分析、三元關(guān)聯(lián)分析、多元關(guān)聯(lián)分析，使研究內(nèi)容更加系統(tǒng)化，致力于深入挖掘生命現(xiàn)象背后的轉(zhuǎn)錄調(diào)控問題。
ceRNA（競爭性內(nèi)源RNA）機(jī)制示意圖
Wang Y et al., Trends Genet, 2016
1. 雙文庫構(gòu)建：small RNA文庫和去核糖體的鏈特異性文庫，烈冰 8年建庫經(jīng)驗(yàn)，保證建庫質(zhì)量；
2. 4種RNA全方位分析：不僅能定量分析已知的lncRNA和miRNA，還能通過Stringtie重建轉(zhuǎn)錄本預(yù)測新的lncRNA；并通過預(yù)測的circRNA進(jìn)行靶向分析 ，從而得到miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA、以及circRNA-miRNA的靶向關(guān)系；
3. 數(shù)據(jù)庫全面整合：整合并定時升級生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)數(shù)據(jù)庫和靶基因預(yù)測算法，如NP Inter、miRBase、RNAhybrid等，保證分析結(jié)果緊跟行業(yè)前沿；
4. 上游測序+下游驗(yàn)證：客戶只需提供細(xì)胞，組織或者總RNA，烈冰為您完成從上機(jī)測序到數(shù)據(jù)分析整套服務(wù)流程，同時可進(jìn)行后續(xù)qPCR驗(yàn)證。
組織樣品：
1. 動物組織≥1g；
2. 植物組織≥2g；
3. 細(xì)胞樣品≥1×106個；
4. 全血≥5mL；
5. 菌體≥106個或≥30mg。
RNA樣品：
1. 樣品需求量： RNA≥10 μg；
2. 樣品濃度：RNA樣品≥100 ng/μl；
3. 樣品純度：OD260/OD280在1.8-2.2之間，OD260/OD230≥2，28S/18S≥1，動物樣品RIN≥7.0，植物樣品RIN≥6.5，RNA無明顯降解。
1. 客戶樣本：細(xì)胞量在106以上；
2. 總RNA提取及質(zhì)控：凝膠電泳質(zhì)控→Nanodrop質(zhì)控→Agilent 2200質(zhì)控；
3. small RNA文庫構(gòu)建：切膠范圍10-50bp，單端測序SE50，文庫分子18-30bp；
4. 去核糖體文庫構(gòu)建：逆轉(zhuǎn)錄后用RNase處理，去除rRNA；
5. 上機(jī)測序：烈冰建議選擇NovaSeq，雙端測序，通量大，堿基精度高，而且成本低，速度快。
差異lncRNAs火山圖分析和聚類分析
Yang F et al., Gene, 2016
注：(A)差異lncRNA火山圖分析結(jié)果，紅色表示顯著差異的lncRNA，藍(lán)色表示非顯著差異的lncRNA；(B)差異lncRNA聚類分析的Heat map，紅色越深表示lncRNA上調(diào)越顯著，藍(lán)色越深表示lncRNA下調(diào)越顯著。
lncRNA-miRNA靶向作用關(guān)系
Miao X et al., Sci Rep, 2016
注：紅色三角表示上調(diào)lncRNAs，綠色三角表示下調(diào)lncRNAs，紫色V型三角表示上調(diào)miRNAs，藍(lán)色V型三角表示下調(diào)miRNAs。
lncRNA-miRNA-mRNA Network
Miao X et al., Sci Rep, 2016
注：紫色三角形表示lncRNA，紅色圓點(diǎn)表示mRNA，黃色圓點(diǎn)表示關(guān)鍵mRNA，藍(lán)色V型三角表示miRNA。
差異基因GO分析和Pathway分析
Xu T et al., Oncogene. 2015
注：（a）lncRNA TINCR-siRNA VS scrambled siRNA差異基因聚類分析圖；（b）差異基因顯著富集的pathway條目；（c）差異基因顯著富集的GO條目。
circRNA預(yù)測工作流和預(yù)測結(jié)果（正常組織 VS 癌組織）
Chen W et al., Nat Neurosci. 2015/Zheng Q et al., Nature Communications, 2016
注：(a)橫坐標(biāo)表示circRNA反向剪接reads數(shù)，縱坐標(biāo)表示circRNA數(shù)量；(b)circRNA在基因組結(jié)構(gòu)上的分布；(c)橫坐標(biāo)表示exonic circRNA長度，縱坐標(biāo)表示circRNA數(shù)量。
差異circRNA分析結(jié)果
Liu Q et al., Scientific Reports, 2016
注：左圖為差異circRNA的聚類分析圖(OA VS normal軟骨組織)；右圖為差異circRNA的火山圖，紅點(diǎn)表示差異顯著的circRNA。
circRNA-miRNA相互作用
Zheng Q et al., Nature Communications, 2016
注：該圖展示了circHIPK3相互作用的miRNAs的假定結(jié)合位點(diǎn)。
circRNA-miRNA-mRNA Network
Liu Q et al., Scientific Reports, 2016
注：綠色圓點(diǎn)表示circRNA，黃色菱形表示mRNA，紫色V型三角表示miRNA。
circRNA和蛋白編碼基因的WGCNA分析
Wang Z et al. Frontiers in plant science, 2017
注：該圖為WGCNA計(jì)算出來的不同module，與不同表型相關(guān)性高的module，并對moudle16以及兩個circRNA的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖分別進(jìn)行了可視化展示。
E50 VS E40和E60 VS E50差異mRNA/lncRNA韋恩圖
Li Y et al., BioMed Research International. 2019
注：左圖為E50 VS E40差異mRNA和E60 VS E50差異mRNA的韋恩分析結(jié)果；右圖為E50 VS E40差異lncRNA和E60 VS E50差異lncRNA的韋恩分析結(jié)果。
干預(yù)LncRNA GAS5的基因富集分析
Liu et al., Nat Commun, 2016
注：該圖為LncRNA GAS5過表達(dá)和敲低后，hESCs的基因富集分析結(jié)果。其中，ES表示富集度得分，NES表示ES標(biāo)化后的值，得分越高表示該基因類別與該干預(yù)呈正相關(guān)。
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