MutMap的分析方法如下圖：

選擇EMS處理的突變體進(jìn)行回交獲得F1子代，再自交獲得形狀分離的F2子代，選擇F2中具有突變形狀的植株進(jìn)行混池測序，理論上與突變性狀相關(guān)的突變率為1，而與突變性狀不相關(guān)的突變率接近0.5，再繪制snp-index

與染色體位置的圖，鎖定峰值所在的區(qū)域進(jìn)行驗證，如下圖：

藍(lán)色的點代表突變位點，紅色的線是根據(jù)windows分析的結(jié)果繪制，每個window包含五個snp位點，縱坐標(biāo)取突變率的平均值，橫坐標(biāo)取第一和第五的突變位置的中點

圖中snp位點的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：

1.突變頻率與覆蓋度

   純合位點認(rèn)為SNP-index大于等于0.9且覆蓋度大于等于3

   雜合位點認(rèn)為SNP-index大于等于0.3且小于0.9，覆蓋度大于4

2.去除不同樣本間共有突變

   去除掉至少有兩個突變方向共有的SNP位點

3.根據(jù)EMS誘導(dǎo)突變原理篩選

   由于EMS誘導(dǎo)的突變主要集中在G→A和C→T，所以圖中只保留了這兩種突變

在文章的附件中給出了一系列不同覆蓋度與不同混樣數(shù)量情況下，性狀不相關(guān)突變位點在SNP-index上的頻率分布圖

其中n代表混養(yǎng)池中樣本的數(shù)量，G代表平均覆蓋度，由圖中來判斷出純合突變的SNP-index閾值

此外，mutmap方法還考慮了在突變株中存在極少量不突變的樣本情況，也給出了在這種考慮下的與性狀相關(guān)SNP在SNP-index上的頻率分布圖，如下：

其中j代表假設(shè)的未突變樣本數(shù)，n代表混養(yǎng)池中樣本的數(shù)量，G代表平均覆蓋度

NovelBio實驗室數(shù)據(jù)測試：

本次測試主要使用的測試樣本為A，其中陳總給出的突變基因為XXX，所在染色體的位置為：XXXX

測試中使用Varscan算法對xxx與對照組9522樣本進(jìn)行callSNP，提取其中的somatic突變進(jìn)行后續(xù)的分析，其中包含一個在目標(biāo)基因上發(fā)生錯義突變的位點，且突變率為1.

由圖中可以看出具有高突變率的位點較多，在11號染色體關(guān)注基因區(qū)域沒有明顯的峰值，在第一，第四染色體有明顯的突變富集，但是突變位點過于密集，經(jīng)過IGV觀察后看到如下情況：

1.目的基因處的突變位點為真，但是突變位點周圍沒有很多高頻突變位點，導(dǎo)致圖中沒有明顯的峰

2.在大量突變位點富集的區(qū)域，在對照組中也存在非常多的突變，導(dǎo)致結(jié)果不可信，而且在該位點存在過多的位點也使結(jié)果不是很可信

3.根據(jù)覆蓋度的過濾會存在局限性，有部分位點可能同時存在多種突變類型，或者snp和indel共存的情況，這種位點也不是非?？尚?/span>

4.部分位點存在幾個位置接近的純合突變位點，圖中存在不是非常明顯峰的區(qū)域，但是不在基因的外顯子區(qū)，未發(fā)生氨基酸的改變

初步結(jié)論，從圖中來看，沒有達(dá)到文章中出現(xiàn)明顯峰的程度，考慮的原因是突變位點過多，產(chǎn)生的干擾比較嚴(yán)重，XXX這個樣本的平均覆蓋度為24，已經(jīng)達(dá)到文章中提到的（>10×)的要求，但是畫圖使用的突變位點的數(shù)量相差一個數(shù)量級，對結(jié)果的影響很大。在Mutmap的文章中同時對一批F2子代的多種突變類型進(jìn)行研究比如高矮，葉片顏色，并刪除了很多共有突變（即可能不特異影響突變性狀的位點），而且只考慮了G→A和C→T這兩種突變類型，這就可以過濾掉非常多的位點。而在我們的測序數(shù)據(jù)中，只考慮了覆蓋度的問題，在我對覆蓋度梯度測試時，始終不能達(dá)到滿意的結(jié)果，卡值過低，繪圖所使用的突變位點會更多，干擾非常大，如果卡值過高又會丟掉非常多的信息。此外，由于陳總關(guān)注的目的基因所具有的突變類型為C→G，而且也不知道具體誘導(dǎo)突變的過程，沒有對位點的突變種類進(jìn)行篩選，這個也是導(dǎo)致突變位點很多的原因之一。

Q69樣本補(bǔ)充分析，選擇Q69的somatic突變位點進(jìn)行過濾畫圖，過濾標(biāo)準(zhǔn)為tumor組覆蓋度大于等于8，突變率大于30%，normal組突變率為0，只選擇G→A和C→T這兩種突變類型進(jìn)行分析，

總共獲得突變位點2173個，結(jié)果圖片如下：

之后在對覆蓋度的卡值進(jìn)行梯度測試，由于在當(dāng)時進(jìn)行varscan分析時平臺的tumor最低閾值為8，當(dāng)卡值為8時獲得2173個突變，當(dāng)卡值為10時獲得 當(dāng)卡值為1085個，15時獲得375個突變位點。