一 引言

1.1編寫目的

進(jìn)行該測(cè)試以及撰寫此報(bào)告有以下幾個(gè)目的

1.通過(guò)對(duì)測(cè)試結(jié)果的分析，得到對(duì)軟件質(zhì)量的評(píng)價(jià)；

2.分析在Illumina測(cè)序平臺(tái)下，tophat能夠獲得最大junction數(shù)目以及mapping率的參數(shù)；

3.分析在ionproton測(cè)序平臺(tái)下，tophat能夠獲得最大junction數(shù)目以及mapping率的參數(shù)；

4.嘗試找到參數(shù)與測(cè)序長(zhǎng)度的經(jīng)驗(yàn)性關(guān)系。

1.2背景

Tophat是一個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)分析工具，其核心程序是bowtie或bowtie2.可以快速的確認(rèn)exon-exon剪切拼接。其上游軟件是Bowtie，下游軟件是Cufflinks。

理論上，Tophat是針對(duì)Illumina Genome Analyzer開發(fā)的，針對(duì)75bp以上長(zhǎng)度的短序列進(jìn)行了優(yōu)化。該軟件是現(xiàn)在二代測(cè)序回帖軟件中使用最廣泛的軟件。

Illumina屬于二代測(cè)序中最經(jīng)典的平臺(tái)之一。其測(cè)序長(zhǎng)度為幾十bp。

Ionproton屬于二代測(cè)序中較新的平臺(tái)，可以認(rèn)為是二點(diǎn)五代測(cè)序平臺(tái)，其測(cè)序長(zhǎng)度平均在100個(gè)bp以上。目前我們公司使用的就是這個(gè)平臺(tái)的進(jìn)行二代測(cè)序分析。

在目前公司的數(shù)據(jù)分析中，出現(xiàn)主要的問(wèn)題是使用tophat進(jìn)行ionproton平臺(tái)分析時(shí)，默認(rèn)參數(shù)的mapping率較低，同時(shí)該參數(shù)產(chǎn)生的junction數(shù)也很低，不足以進(jìn)行差異可變剪接分析。因此，提出此次工作內(nèi)容，探索更好的參數(shù)配置，提高mapping率以及junction數(shù)目。

1.3用戶群

主要讀者：公司研發(fā)部，公司管理人員。

其他讀者：項(xiàng)目及銷售相關(guān)人員。

1.4 數(shù)據(jù)對(duì)象：

1.5 測(cè)試階段

軟件測(cè)試

1.6測(cè)試工具

Samtools version：0.1.18；

IGV version：2.3.18；

Awk；

1.7 參考資料

《Tophat user guide》

二 測(cè)試概要

關(guān)于Tophat參數(shù)測(cè)試從2013年9月10日開始到2013年9月17日結(jié)束，共持續(xù)7天，一共94個(gè)測(cè)試用例，平均每個(gè)參數(shù)測(cè)試15次。

2.1工作計(jì)劃進(jìn)展

針對(duì)Illumina平臺(tái)：

測(cè)試參數(shù)	計(jì)劃開始時(shí)間	實(shí)際開始時(shí)間	計(jì)劃完成時(shí)間	實(shí)際完成時(shí)間	工作完成情況
Anchor-length	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	順利
Max-insertion	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	順利
Max-deletion	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	順利
Splice-mismatch	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	2013年9月10日	順利
Read-mismatch	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	順利
Read-gap-length	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	順利
Read-edit-dist	2013年9月11日	2013年9月11日	2013年9月12日	2013年9月12日	順利
Segment-length	2013年9月12日	2013年9月12日	2013年9月12日	2013年9月12日	順利

針對(duì)ionproton平臺(tái)：

測(cè)試參數(shù)	計(jì)劃開始時(shí)間	實(shí)際開始時(shí)間	計(jì)劃完成時(shí)間	實(shí)際完成時(shí)間	工作完成情況
Anchor-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Max-insertion	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Max-deletion	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Splice-mismatch	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Read-mismatch	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Read-gap-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Read-edit-dist	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利
Segment-length	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	2013年9月16日	順利

2.2測(cè)試執(zhí)行

此次測(cè)試嚴(yán)格按照項(xiàng)目計(jì)劃和測(cè)試計(jì)劃執(zhí)行，按時(shí)完成了測(cè)試計(jì)劃規(guī)定的測(cè)試對(duì)象的測(cè)試。針對(duì)測(cè)試計(jì)劃制定規(guī)定的測(cè)試策略，依據(jù)測(cè)試計(jì)劃和測(cè)試用例，將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)以及我們觀測(cè)的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了完整的測(cè)試。

2.3測(cè)試用例

2.3.1功能性

測(cè)試主要實(shí)現(xiàn)，包括較高的mapping率以及較多的junction數(shù)目。

三 測(cè)試環(huán)境

3.1軟硬件環(huán)境

四 測(cè)試結(jié)果

4.1針對(duì)Illumina測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)

為簡(jiǎn)化回帖工作量，從測(cè)試的數(shù)據(jù)中提取了20萬(wàn)條reads數(shù)據(jù)進(jìn)行單端測(cè)試。

通過(guò)測(cè)試，統(tǒng)計(jì)出anchor-length長(zhǎng)度對(duì)于junction數(shù)目關(guān)系如下圖所示：

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于Illumina測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，當(dāng)anchor-length大于10以后，junction數(shù)目顯著降低，而在5到10這個(gè)范圍內(nèi)沒(méi)有顯著變化。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于Illumina測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，當(dāng)anchor-length大于10以后，mapping率降低，但是可以通過(guò)豎軸可以觀測(cè)出這個(gè)mapping率的變化并不明顯。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于Illumina測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，junction數(shù)目與mapping率基本成正比關(guān)系。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于Illumina測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，read-mismatch數(shù)字升高與junction數(shù)目基本成反比關(guān)系，隨著read-mismatch數(shù)目變長(zhǎng)，junction數(shù)目急速降低。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于Illumina測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，read-mismatch數(shù)字升高與mapping率基本成正比關(guān)系，隨著read-mismatch數(shù)目變長(zhǎng)，mapping率上升明顯。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于Illumina測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，read-gap數(shù)字升高與mapping率基本成正比關(guān)系，隨著read-mismatch數(shù)目變長(zhǎng)，mapping率上升。整體上升大約1.2%。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于Illumina測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，segment長(zhǎng)度升高與junction的數(shù)目關(guān)系，在二十以內(nèi)時(shí)，segment長(zhǎng)度變長(zhǎng)，junction數(shù)目上升明顯。隨著read-mismatch數(shù)目變長(zhǎng)，mapping率上升。整體上升大約1.2%。

3.2針對(duì)ionproton測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)

為簡(jiǎn)化回帖工作量，從測(cè)試的數(shù)據(jù)中提取了20萬(wàn)條reads數(shù)據(jù)進(jìn)行單端測(cè)試。

由于有了對(duì)于Illumina平臺(tái)的工作支持，所以針對(duì)ionproton的測(cè)試工作速度提高很多。

由于我們統(tǒng)一了read-mismatch參數(shù)，read-gap參數(shù)，以及read-edit參數(shù)。所以這三個(gè)參數(shù)的測(cè)試圖都可以從上圖中看出信息。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于ionproton測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，針對(duì)同一anchor-length長(zhǎng)度而言，長(zhǎng)度8和長(zhǎng)度15，16的情況下junction數(shù)目可以一致，所以認(rèn)為anchor-length對(duì)junction數(shù)目影響不明顯。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于ionproton測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，針對(duì)同一max-deletion長(zhǎng)度而言，長(zhǎng)度3和長(zhǎng)度5的情況下junction數(shù)目可以一致，所以認(rèn)為max-deletion對(duì)junction數(shù)目影響不明顯。

由于我們統(tǒng)一了max-insertion參數(shù)，max-deletion參數(shù)。所以這兩個(gè)個(gè)參數(shù)的測(cè)試圖都可以從上圖中看出信息。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于ionproton測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，在segment-length小于36時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)隨著segment-length長(zhǎng)度變長(zhǎng)，junction數(shù)目升高。而在36以后這個(gè)數(shù)字下降，但是總體比30以內(nèi)長(zhǎng)度的大。

通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道對(duì)于ionproton測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)而言，在segment-length小于36時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)隨著segment-length長(zhǎng)度變長(zhǎng)，mapping總體目升高。而在36以后這個(gè)數(shù)字有下降的情況，但是總體比30以內(nèi)長(zhǎng)度的大。

五．測(cè)試結(jié)論

通過(guò)查閱已經(jīng)有的資料，我們知道Illumina測(cè)序平臺(tái)和ionproton平臺(tái)最直觀的差別在于后者的平均測(cè)序長(zhǎng)度比前者長(zhǎng)；在我們測(cè)試的例子中，Illumina的測(cè)序長(zhǎng)度在50-97個(gè)bp之間，而ionproton的測(cè)序長(zhǎng)度在50到235個(gè)bp之間。從此可以看出兩者的最合適參數(shù)應(yīng)該是有差別的。通過(guò)我們的參數(shù)實(shí)驗(yàn)，可以知道，對(duì)于Illumina測(cè)序平臺(tái)有如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.貼合長(zhǎng)度越短，匹配的reads數(shù)越高，相應(yīng)的mapping率也在一定范圍內(nèi)會(huì)升高?？芍?，只需要在anchor-length在5-10以內(nèi)進(jìn)行討論。隨著a參數(shù)的增加（從5到10），junction下降的數(shù)據(jù)很低，幾乎維持不變。因此可以認(rèn)為在5-9的范圍內(nèi)可以任意取值。

2.前三個(gè)參數(shù)對(duì)于序列的discard沒(méi)有影響。

3.隨著第一項(xiàng)參數(shù)的增加，junction數(shù)目下降很明顯，然而mapping率卻增加的很快。推測(cè)這個(gè)原因可能是因?yàn)楦嗟?/span>junction序列由于容錯(cuò)而變成能夠匹配了。所以為了mapping率而言，我認(rèn)為用默認(rèn)參數(shù)就可以。

4.第二項(xiàng)參數(shù)的變化對(duì)于junction數(shù)并沒(méi)有影響，對(duì)于mapping率有一些影響，但是很小。可以再0~第三項(xiàng)參數(shù)之間隨意選取。

5.第三項(xiàng)參數(shù)的變化對(duì)mapping率影響很小。但是對(duì)junction的影響很大，發(fā)現(xiàn)這個(gè)參數(shù)越小，junction數(shù)越高。第三個(gè)參數(shù)對(duì)于junction的影響很大，這個(gè)值越小越好，由于前兩個(gè)參數(shù)應(yīng)該小于或等于這個(gè)參數(shù)，當(dāng)?shù)谌齻€(gè)參數(shù)為0時(shí)，mapping率下降非常厲害，所以不將前三個(gè)參數(shù)設(shè)置為0，

6.當(dāng)segment-length為22的時(shí)候效果最好。

對(duì)于ionproton測(cè)序平臺(tái)而言，我們可以獲得如下結(jié)論：

1.anchor-length，max-deletion，max-insertion，splice-mismatch參數(shù)的變化對(duì)于junction數(shù)目，mapping率影響不大。

2.在tophat的所有的參數(shù)中，read-mismatch，read-gap以及read-edit對(duì)于mapping率的影響很大，我們發(fā)現(xiàn)在這三個(gè)參數(shù)都設(shè)置為6的時(shí)候mapping率能夠提升很多，變成默認(rèn)參數(shù)情況下的兩倍的mapping率。

3.我們發(fā)現(xiàn)segment-length參數(shù)對(duì)于junction數(shù)目變化有很大影響，其中，當(dāng)segment-length為36時(shí)，相比默認(rèn)參數(shù)6074junction數(shù)目而言，此時(shí)的junction數(shù)目為9368.總體而言，提升效果是顯著的。

六．最后測(cè)試的參數(shù)

對(duì)于20萬(wàn)reads的實(shí)驗(yàn)樣本而言，參數(shù)及結(jié)果如下：

測(cè)試平臺(tái)	read-mismatch	read-gap-length	read-edit-dist	a	m	maxinsertion	max-deletion	segment	junction_num	unmapped
Illumina	1	1	1	8	1	3	3	22	4957	42902
ionproton	6	6	6	8	0	5	5	36	9368	96725