一、CIRI簡(jiǎn)介：

CIRI 根據(jù)circRNA 連接點(diǎn)處的reads來(lái)識(shí)別circRNA， 在連接點(diǎn)處的reads 其比對(duì)情況非常特殊；

CIRI 根據(jù)3種模型來(lái)識(shí)別circRNA， 連接點(diǎn)處的read 叫做junction read

A)

circRNA 由3個(gè)外顯子環(huán)化形成， 由于測(cè)序讀長(zhǎng)的限制，junction read 只覆蓋了起始外顯子和終止外顯子的部分序列，這兩部分reads的比對(duì)位置在基因組上的位置是相反的

circRNA 由3個(gè)外顯子環(huán)化形成， 由于連接點(diǎn)處的一個(gè)外顯子其長(zhǎng)度太短，junction read 除了覆蓋了起始外顯子和終止外顯子的兩部分序列外，還覆蓋了中間的一個(gè)外顯子的部分序列

C)

circRNA 由1個(gè)外顯子環(huán)化形成, junction read 除了覆蓋了整個(gè)外顯子外，還重復(fù)又讀了一部分序列

D）

為了進(jìn)一步降低假陽(yáng)性率，CIRI 通過(guò)以下3條規(guī)則對(duì)結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾：

1）雙端測(cè)序的兩條reads 必須符合PEM 信號(hào)，以上面的示意圖為例，進(jìn)行說(shuō)明read1 是一條junction read, 來(lái)源于兩個(gè)外顯子，根據(jù)read1 的比對(duì)情況，確定了circRNA 在基因組上的位置，此時(shí)，如果這個(gè)circRNA 識(shí)別準(zhǔn)確，那么read2 就肯定落在對(duì)應(yīng)的位置內(nèi)；

根據(jù)兩條reads的比對(duì)情況，進(jìn)一步過(guò)濾結(jié)果；

2） 檢測(cè)到的circRNA 的連接處符合AG-GT 剪切信號(hào)；

3）根據(jù)比對(duì)的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行過(guò)濾，質(zhì)量就是說(shuō)mapping 的質(zhì)量越高，識(shí)別的circRNA 越準(zhǔn)確；數(shù)量就是說(shuō)對(duì)于某個(gè)circRNA來(lái)說(shuō)，檢測(cè)到的juntion reads 越多，說(shuō)明這個(gè)circRNA越可靠；

上面圖中的幾種模型只是幫助我們理解了exonic-circRNA的檢測(cè)，其實(shí)對(duì)于non-exonic circRNA（包括intronic  circRNA 和 intergenic circRNA)的檢測(cè)，其原理是相似的，只是綜合考慮了測(cè)序讀長(zhǎng)和連接點(diǎn)兩段序列的長(zhǎng)度，提出幾種可能的比對(duì)模型，然后根據(jù)比對(duì)模型來(lái)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的junction reads, 從而預(yù)測(cè)circRNA;

circRNA 結(jié)果的驗(yàn)證：

以一個(gè)預(yù)測(cè)得到的circRNA chr2: 58,311,224|58,316,858 為例，在基因組上的長(zhǎng)度為 5634bp, 其連接點(diǎn)為VRK2基因的exon6和exon10

理論上產(chǎn)生的circRNA的序列為所有外顯子組成的序列，splicing length為407bp

為了驗(yàn)證該circRNA , 根據(jù)連接點(diǎn)兩端的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出該circRNA 片段，跑電泳，確定產(chǎn)物長(zhǎng)度

圖中的黑色片段為擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，根據(jù)PAGE 電泳的結(jié)果，確定其長(zhǎng)度；然后進(jìn)行一代測(cè)序，確定具體序列

文獻(xiàn)：

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-014-0571-3#Sec18

二、CIRI安裝

2.1 下載地址：

https://sourceforge.net/projects/ciri/files/latest/download

2.2 安裝方法：

解壓即可。

三、CIRI使用方法

Usage: perl CIRI.pl -I in.sam -O output.ciri -F ref.fa (-R ref_dir/)

Arguments:

-I, --in

input SAM file name (required; generated by BWA-MEM)

-O, --out

output circRNA list name (required)

-F, --ref_file

FASTA file of all reference sequences. Please make sure this file is

the same one provided to BWA-MEM. Either this argument or

-R/--ref-dir is required.

-R, --ref_dir

directory of reference sequence(s). Please make sure fasta files in

this directory are from the FASTA file(s) provided to BWA-MEM. Either

this argument or -F/--ref-file is required.

-A, --anno

input GTF/GFF3 formatted annotation file name (optional)

-G, --log

output log file name (optional)

-H, --help

show this help information

-S, --max_span

max spanning distance of circRNAs (default: 200000)

-high, --high_strigency

use high strigency: only output circRNAs supported by more than 2

distinct PCC signals (default)

-low, --low_strigency

use low strigency: only output circRNAs supported by more than 2

junction reads

-0, --no_strigency

output all circRNAs regardless junction read or PCC signal counts

-U, --mapq_uni

set threshold for mappqing quality of each segment of junction reads

(default: 10; should be within [0,30])

-E, --rel_exp

set threshold for relative expression calculated based on counts of

junction reads and non-junction reads (optional: e.g. 0.1)

-M, --chrM

tell CIRI2 the ID of mitochondrion in reference file(s) (default:

chrM)

-T, --thread_num

set number of threads for parallel running (default: 1)

-Q, --quiet

keep quiet when running

-D, --output_all

keep the temporary files after running (more disk space would be

needed)

四、檢測(cè)流程

1.使用BWA-MEM進(jìn)行比對(duì)，

2.使用CIRI2進(jìn)行檢測(cè)，使用命令如：perl CIRI2.pl -I sample.sam -O test.ciri -F chr1.fa -D -Q -0 -S 200000 -A

CIRI 運(yùn)行過(guò)程中所需要的內(nèi)存資源比較多