在高通量測序領域，流傳著一句話，叫做“Junk in, junk out.”，這就意味著要想得到一個好的數(shù)據(jù)分析結果，就需要對前期的每一步操作都進行嚴格的把關，包括樣本的制備、測序以及數(shù)據(jù)的前期處理等。在整個單細胞測序實驗過程中，前期樣本的選取以及單細胞懸液的制備是整個實驗成敗的第一步。當獲得單細胞懸液之后，如何精準的判斷細胞的質量、監(jiān)控單個細胞的分選效果則顯得更為重要，因為這一步直接關系著最后測序數(shù)據(jù)的質量以及數(shù)據(jù)分析結果的好壞。因此就需要對整個實驗流程進行嚴格的質控和記錄。

NovelBio使用的單細胞分選系統(tǒng)（BD Rhapsody）可以對實驗過程中從單細胞懸液質量評估到Single Cell分選標記的每一個步驟進行質控及記錄，包括單細胞懸液中細胞數(shù)量、活性的檢測，單細胞分選標記過程中細胞、磁珠的鋪板情況、細胞被磁珠捕獲標記的情況以及雙細胞的比例等，在獲取實驗過程中關鍵信息的同時，也有效保證了實驗結果的可靠性。

圖1 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)

1、 單細胞懸液質量評估

細胞數(shù)量、細胞活性的精準判斷對Single Cell分選標記、建庫、下機數(shù)據(jù)的質量都具有著決定性的作用。如若細胞計數(shù)偏高，將會影響建庫的成功率；計數(shù)偏低，則會顯著提高雙細胞的比例；而細胞活率過低，就會使測序數(shù)據(jù)的利用率大打折扣，因此把好單細胞懸液質量這一關尤為重要。

BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)集成了熒光顯微成像系統(tǒng)，可以對不同熒光標記的細胞進行檢測并計數(shù)。在進行質量評估之前，首先要將細胞的培養(yǎng)體系更換成上機所需的Buffer。在這個過程中，需要進行多次離心、重懸操作，Novelbio單細胞實驗團隊推薦采用水平轉子離心機來進行這步操作（下圖左）。這種離心機可以有效減少細胞在多次更換Buffer過程中的損失，尤其是對于細胞量較少的樣本來說，顯得非常有必要。更換完Buffer之后，還需要將細胞進行過篩操作，去除較大的細胞團，獲得較為純凈的單細胞懸液。

圖2 單細胞重懸、過篩操作

在更換完Buffer之后在實驗中，可以通過Calcein AM和Draq7對細胞進行染色，兩種染料分別標記單細胞懸液中的活細胞以及死細胞，37℃避光孵育后（下圖左上），將細胞懸液加入血球計數(shù)板（下圖左下），載入BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)中進行熒光顯微成像（下圖右），對細胞的狀態(tài)進行評估。

圖3 細胞染色并上機檢測

當BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)對染色后的細胞進行掃描并照相后，根據(jù)明場及熒光成像結果，可以對單細胞懸液中的細胞數(shù)量、活細胞比例進行計算，進而對單細胞懸液的質量進行評估。結果如下圖所示，其中左上、右上、左下分別為同一視野下的明場、綠色熒光、紅色熒光結果，右下為數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果，計算并獲得了細胞總數(shù)及活細胞比例。

圖4 細胞計數(shù)及活性檢測結果

2、 細胞鋪板

當單細胞懸液滿足鋪板要求后，就可以進行單細胞分選標記操作了，在這一步，主要用到的儀器和耗材有如下幾種，分別為BD Rhapsody單細胞分選儀（下圖左上），BD Cartridge單細胞分選蜂巢板（下圖右上），BD Rhapsody 電動移液器（下圖左下）。

圖5 BD Rhapsody單細胞鋪板設備及耗材

在單細胞的鋪板過程中，由于不同操作人員手法具有不可避免的差異，不同的液體流速將直接影響單細胞的入孔效果。因此BD Rhapsody分選平臺還專門配套了定制的電動移液器，其具有Prime Treat、Cell Load、Bead Load、Wash、Lysis、Retrieval多種操作模式，來對應各種不同的操作。通過已經(jīng)設定的程序來控制液體的流速，大幅度降低人為操作習慣帶來的差異，保證實驗操作的一致性。

圖6 BD Rhapsody單細胞分選定制電動移液器

根據(jù)已有的細胞計數(shù)結果，將單細胞懸液稀釋到合適的鋪板濃度后，就可以進行鋪板操作了。待細胞因重力落入蜂巢孔內(nèi)后，可以通過BD Rhapsody成像系統(tǒng)對細胞的真實入孔情況進行檢測，根據(jù)圖像結果可以清楚看到每個孔內(nèi)是否有細胞落入以及落入多少個細胞，統(tǒng)計并評估實際的鋪板效果。（下圖）。

圖7 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)細胞鋪板情況檢測

3、 磁珠鋪板及清洗

待細胞鋪板完成后，就需要往BD Cartridge蜂巢板中加入過量磁珠，來保證大部分孔內(nèi)都能夠落入磁珠（下圖左），隨后再用Buffer清洗去除多余的磁珠（下圖右）。整個過程同樣可以通過BD Rhapsody成像系統(tǒng)進行掃描，評估磁珠的實際鋪板情況，并統(tǒng)計分析得到細胞和磁珠落入同一孔內(nèi)的數(shù)量，獲得細胞的真實捕獲情況。

圖8 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)磁珠鋪板情況檢測

4、 細胞裂解及磁珠收集

當蜂巢孔內(nèi)同時落入細胞和磁珠后，接下去可以往BD Cartridge板中加入細胞裂解液對細胞進行裂解，使細胞內(nèi)的RNA與磁珠上的標簽進行結合，完成每個細胞內(nèi)RNA的捕獲和標記。這時，再將捕獲了RNA的磁珠進行回收，待所有質控結果確認通過后就可以進行后續(xù)的RNA反轉錄、cDNA第二鏈合成等實驗操作。而BD Cartridge板則需要再進行一次成像，獲得磁珠收集后的掃描圖，判斷磁珠是否已經(jīng)被有效收集。

圖9 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)磁珠收集后檢測圖

5、 實驗總結報告

根據(jù)每一步的質控結果，烈冰科技（NovelBio）單細胞實驗團隊會根據(jù)單細胞分選的實驗結果生成實驗總結報告，判斷每一步驟是否通過質控，并得到最終捕獲的單細胞數(shù)量以及雙細胞比例，對整個實驗進行總結評估。若所有過程通過質控，實驗樣本即可進行下一步實驗操作。

圖10 實驗總結報告

6、 烈冰團隊助力單細胞研究

單細胞測序技術（Single Cell Sequencing）從一種新興的研究角度，借助已有的高通量測序手段，幫助研究者在腫瘤異質性、腫瘤微環(huán)境、發(fā)育學、免疫學以及其他領域中進行單細胞層面的數(shù)據(jù)解析，解決了Bulk Population Sequencing所無法解決的問題。這樣一個新的研究領域必然也需要足夠可靠的實驗手段來支撐。BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)為此提供了完善的硬件設備，保證了從單細胞懸液質量評估到單細胞分選標記過程中每一個實驗步驟的精準質控。NovelBio單細胞實驗團隊借助BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)，在實驗實施層面對單細胞測序結果的可靠性提供了強有力的保證。繼單細胞懸液制備之后，又在另一道關鍵關卡提供了可靠的支持，幫助研究者在單細胞測序領域收獲更多的成果。