單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-Seq）

已成為目前最炙手可熱的科研技術(shù)之一，在揭示細(xì)胞間狀態(tài)、轉(zhuǎn)變和細(xì)胞間差異表達(dá)中有重要的意義。目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤、神經(jīng)、發(fā)育等領(lǐng)域。

2021 年 1 月，上海長(zhǎng)海醫(yī)院任善成教授與加拿大多倫多大學(xué) Housheng Hansen He 教授、復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院王建華教授合作在 Nature Cell Biology 雜志發(fā)表了題為「Single-cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression」論文。

（圖片來(lái)源：Nature Cell Biology）

文章通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，解析了前列腺癌腫瘤微環(huán)境的高度異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)了臨床病理和影像學(xué)無(wú)法識(shí)別的微轉(zhuǎn)移灶，還揭示了癌細(xì)胞通過(guò)外泌體的方式馴化免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組使其表達(dá)腫瘤基因，這些都對(duì)前列腺癌治療靶點(diǎn)的確定和侵襲性腫瘤生物標(biāo)志物的研發(fā)開(kāi)拓了思路。

下文由負(fù)責(zé)這篇文章單細(xì)胞生物信息學(xué)分析的作者，來(lái)自烈冰生物的張博撰寫，主要針對(duì)單細(xì)胞測(cè)序如何應(yīng)用于腫瘤研究，如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)樣本、分析研究數(shù)據(jù)等問(wèn)題進(jìn)行解析。

一、文章概覽

烈冰生物參與了單細(xì)胞測(cè)序中樣本設(shè)計(jì)和單細(xì)胞消化、分選測(cè)序?qū)嶒?yàn)，以及數(shù)據(jù)分析、生物信息學(xué)意義挖掘的工作。

二、研究結(jié)果展示

通過(guò)對(duì) Batch1 進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，注釋細(xì)胞類型主要包括上皮細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞系、T 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞等主要群體。然后分別對(duì)每個(gè)大群進(jìn)一步分析。

Fig.1 13 例前列腺癌樣本的單細(xì)胞研究概況

（圖片來(lái)源：Nature Cell Biology）

1. 與腫瘤預(yù)后相關(guān)的上皮細(xì)胞類型

通過(guò)拷貝數(shù)變異分析、腫瘤細(xì)胞的 marker 基因/信號(hào)通路相關(guān)性分析，將上皮細(xì)胞鑒定為 luminal types、cell-cycle 、basal/intermediate 類型；我們主要研究了這些細(xì)胞類型與臨床預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)細(xì)胞因子 CCL2 的 basal/int. 亞群與前列腺癌有較好的預(yù)后關(guān)系；而 cell-cycle 細(xì)胞亞群則與前列腺癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。

Fig.2  上皮細(xì)胞與 maker 基因相關(guān)性打分情況

（圖片來(lái)源：Nature Cell Biology）

Fig.3  TCGA 預(yù)后關(guān)聯(lián)性分析

（圖片來(lái)源：Nature Cell Biology）

2. 單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移潛在機(jī)制和微轉(zhuǎn)移灶

在 T 細(xì)胞的研究中，我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞竟然表達(dá)前列腺癌特異性基因 KLK3，深入挖掘分析多種類型的單細(xì)胞公共數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn) T 細(xì)胞均表達(dá)相應(yīng)的腫瘤標(biāo)記基因的廣泛特征。

接下來(lái)，以 KLK3 為中心，進(jìn)行了基因與亞群功能相關(guān)性分析、基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn) KLK3 與細(xì)胞外囊泡（EV）和外泌體 PSA 相關(guān)通路被激活，這提示我們腫瘤可能通過(guò)分泌 EV 介導(dǎo) KLK3 轉(zhuǎn)移至 T 細(xì)胞并降低其殺傷功能，為了證明該途徑的可行性，我們反復(fù)通過(guò)流式分選、RNA 熒光原位雜交、免疫組化等驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了表達(dá) PSA/KLK3 的 T 細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)腫瘤細(xì)胞通過(guò)外泌體馴化 T 細(xì)胞使其表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤標(biāo)記基因。

Fig.4  T 細(xì)胞表達(dá)前列腺癌特異性抗原 PSA

（圖片來(lái)源：Nature Cell Biology）

那 EV 轉(zhuǎn)移是否會(huì)影響附近淋巴結(jié)（LNs）以及影響程度如何呢？我們又設(shè)計(jì)了前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本（Batch2）進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，同樣地發(fā)現(xiàn)所有腫瘤樣本的 T 細(xì)胞普遍高表達(dá) KLK3。

有趣的是，其中一例前列腺癌患者的 MRI 影像及術(shù)后病理均提示左右兩側(cè)髂外淋巴結(jié)為陰性，而 scRNA-Seq 細(xì)胞亞群統(tǒng)計(jì)顯示右側(cè)淋巴結(jié)組織中存在高表達(dá) KLK3 的 T 細(xì)胞，提示這可能已經(jīng)形成了「轉(zhuǎn)移前癌巢」結(jié)構(gòu)；而左側(cè)淋巴結(jié)組織中不僅存在高表達(dá) KLK3 的 T 細(xì)胞，還存在惡性上皮細(xì)胞，即左側(cè)淋巴結(jié)已發(fā)生了臨床無(wú)法識(shí)別的微轉(zhuǎn)移灶。

除了這一發(fā)現(xiàn)，我們還注意到 Batch2 樣本采用 BD Rhapsody 平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞分選時(shí)，我們分析存在一群中性粒細(xì)胞，而 Batch1 樣本采用 10X Genomics 分選平臺(tái)的數(shù)據(jù)中沒(méi)有分析到中性粒細(xì)胞的存在。

Fig.5  單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)臨床和影像學(xué)無(wú)法識(shí)別的微轉(zhuǎn)移灶

（圖片來(lái)源：Nature Cell Biology）

3. 基質(zhì)細(xì)胞的分析模式

我們從 signature 基因、pathway 和轉(zhuǎn)錄因子等多角度完整描述了基質(zhì)細(xì)胞的高度異質(zhì)性，并在內(nèi)皮細(xì)胞（EC）中發(fā)現(xiàn)有一部分高表達(dá)腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞（CAF）的相關(guān)特征基因，將其命名為激活的內(nèi)皮細(xì)胞（aECs）。通過(guò)細(xì)胞通訊分析，發(fā)現(xiàn) aEC 與上皮細(xì)胞有強(qiáng)作用關(guān)系，提示其可能影響腫瘤的進(jìn)展。

Fig.6  aEC 與上皮細(xì)胞有強(qiáng)作用關(guān)系

（圖片來(lái)源：Nature Cell Biology）

于是，重新設(shè)計(jì) 11 例不同時(shí)期前列腺癌樣本（Batch3），分選出內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，通過(guò)擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn) aEC 細(xì)胞大部分均來(lái)源于 CRPC 樣本，其亞群占比隨腫瘤進(jìn)展至 CRPC 而逐步升高，表明 aEC 細(xì)胞亞群與前列腺癌惡性進(jìn)展為 CRPC 密切相關(guān)。

我們利用流式分選，證明了大部分 aEC 細(xì)胞亞群來(lái)自于 CRPC 樣本；通過(guò)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn) aEC 細(xì)胞亞群能夠提高前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力，這些實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了 aEC 這一細(xì)胞亞群在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。

Fig.7  aEC 占比與前列腺癌惡性進(jìn)展密切相關(guān)

（圖片來(lái)源：Nature Cell Biology）

三、總結(jié)

我們通過(guò)巧妙地實(shí)驗(yàn)樣本設(shè)計(jì)、深入地 scRNA-Seq 數(shù)據(jù)分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，闡述了前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)了一群與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的新細(xì)胞亞型，對(duì)前列腺癌新型治療策略和預(yù)后指導(dǎo)具有重要意義。

我們整理了一些細(xì)胞群體數(shù)據(jù)收錄進(jìn) NovelBrain 單細(xì)胞瀏覽器中,方便大家搜索關(guān)注的基因。

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