前幾天,小編向大家分享了單細(xì)胞TCR測序技術(shù)在阿爾茲海默氏疾?。ˋlzheimer disease, AD)中的研究,今天烈小冰將為大家?guī)韱渭?xì)胞核測序技術(shù)(Single-nucleus RNA sequence, snRNA-Seq)在AD中的相關(guān)研究。
一、 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(snRNA-Seq)
隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(scRNA-Seq)的蓬勃發(fā)展,其在在胚胎發(fā)育,腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性,免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化等多方面屢建奇功,但是由于細(xì)胞形態(tài)的不同和單細(xì)胞制備中細(xì)胞敏感性的差異等因素影響,scRNA-Seq在數(shù)據(jù)分析時(shí)可能會出現(xiàn)細(xì)胞類型占比失真,個(gè)別細(xì)胞類型丟失等情況。為了克服單細(xì)胞測序技術(shù)的局限性,單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(snRNA-Seq)應(yīng)運(yùn)而生,snRNA-Seq可利用凍存組織直接制備單細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,不僅克服了細(xì)胞形態(tài)差異致使的細(xì)胞捕獲差異,還克服了單細(xì)胞測序必須使用新鮮樣本的多個(gè)局限性。
snRNA-Seq已被廣泛的用于神經(jīng)科學(xué)研究,隨著鼠腦、猴腦、以及人腦細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜的不斷完善,加速推進(jìn)著人類攻克神經(jīng)疾病的步伐。下面就讓我們用一篇文獻(xiàn)走進(jìn)神經(jīng)疾病研究,了解單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)吧。
二、snRNA-Seq在阿爾茲海默氏疾病中的研究
2020年1月,nature medicine 在線發(fā)表了美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Marco Colonna 和 Maxim N. Artyomov團(tuán)隊(duì)的共同研究成果“Human and mouse single-nucleus transcriptomics reveal TREM2-dependent and -independent cellular responses in Alzheimer’s disease ”
阿爾茨海默病(AD)是一種具有復(fù)雜病理生物學(xué)特征的異質(zhì)性疾病,大部分病例發(fā)生在65歲之后,構(gòu)成遲發(fā)性癡呆(late-onset AD)。在病理水平上,AD的起因是因?yàn)?a name="undefined">β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的胞外積累,神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的聚集和過度磷酸化,最終導(dǎo)致神經(jīng)突觸功能障礙和細(xì)胞的死亡。本研究利用snRNA-Seq,深入探討了小膠質(zhì)(Microglia)在AD中的變化,以及小鼠和人在AD病程中膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的差異變化。
三、 分析思路
單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序:
樣本信息:
鼠腦樣本:5×FAD、Trem2-/- 5×FAD、Trem2-/-、WT四種7月齡和15月齡小鼠模型皮質(zhì)/海馬,每組各三只
人腦樣本:AD患病的TREM2-CV(11例)和TREM2-R62H(10例),以及正常人(11例)腦的背外側(cè)前額葉皮質(zhì)
技術(shù)平臺: 10×Genomics系統(tǒng),Illumina HiSeq 4000/6000
四、主要研究成果
(一)通過snRNA-Seq描述β-淀粉樣蛋白和Trem2對小膠質(zhì)細(xì)胞的影響
研究者為探究小鼠對AD病程的轉(zhuǎn)錄響應(yīng),以及β-淀粉樣蛋白和小膠質(zhì)在AD病程中的變化,首先對7月齡的5×FAD小鼠、Trem2敲除的5×FAD小鼠、Trem2敲除小鼠、以及野生型小鼠模型進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序,總共分析了73419個(gè)細(xì)胞核。結(jié)果表明阿爾茲海默癥5×FAD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他小鼠模型(圖1 e-f),同時(shí)研究者們通過對15月齡小鼠模型的分析,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移5×FAD與Trem2敲除后的5×FAD小鼠模型間小膠質(zhì)細(xì)胞差異不再明顯。這說明β-淀粉樣蛋白(Aβ)對小膠質(zhì)的影響部分依賴于Trem2受體。
圖1 5×FAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞增殖性
(二)疾病相關(guān)小膠質(zhì)(DAM)轉(zhuǎn)錄變化依賴于Trem2受體
前人的研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞不僅響應(yīng)AD,同時(shí)還參與AD病程的調(diào)節(jié)。所以研究者們將小膠質(zhì)細(xì)胞作為關(guān)注重點(diǎn),分析了不同樣本、不同年齡段、和不同細(xì)胞類型間的差異基因(DEGs)(圖2)。發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)分類群在不同樣本間有明顯差異(圖2 e-f),在5×FAD小鼠模型中,疾病相關(guān)小膠質(zhì)(Disease-associated microglia, DAM)明顯增多,DAM相關(guān)的Cst7,Csf1,Apoe,Trem2,Lpl,Lilrb4a,H2-d1,Cd74和許多組織蛋白酶基因在5×FAD小鼠中也顯著上調(diào),而小膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)基因P2ry12,Selplg,Tmem119和Cx3cr1則被下調(diào)(圖2 b-d)。進(jìn)一步比較Trem2突變體中的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn),5×FAD中DAM相關(guān)基因的表達(dá)量也較突變體小鼠高,這更加肯定了Trem2(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2)在AD病程反應(yīng)中的重要性,小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化一定程度上受Trem2的影響。
圖2 5×FAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平特性
三、少突膠質(zhì)細(xì)胞的響應(yīng)體現(xiàn)出Aβ依賴性
為深入了解AD病程對大腦細(xì)胞的影響,研究者們將關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)移至除小膠質(zhì)細(xì)胞外的其他細(xì)胞類型,同樣利用差異基因篩選的方法,研究了不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄水平變化,發(fā)現(xiàn)5×FAD小鼠與WT小鼠相比,少突膠質(zhì)細(xì)胞中的C4b,Serpina3a,和H2-d1基因顯著上調(diào),且這些基因在7月齡小鼠(圖3 a)中的表達(dá)顯著高于15月齡小鼠(圖3 b)。同時(shí)通過不同樣本的比較(圖3 c)分析,說明了少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化也可能受到Aβ和Trem2的影響,繼而利用免疫熒光驗(yàn)證了這一猜想(圖3 d-i)。
圖3 在AD病程中少突膠質(zhì)細(xì)胞的變化
綜合單細(xì)胞核測序結(jié)果和免疫熒光結(jié)果,說明在疾病的早期階段,Aβ在小鼠體內(nèi)的積累與少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、活性狀態(tài)是平行關(guān)系,可能是部分依賴Trem2。與此同時(shí),少突膠質(zhì)細(xì)胞C4b和Serpina3n的分泌,可能促進(jìn)Aβ的聚集。
從snRNA-Seq數(shù)據(jù)中可以看出,相比于小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,Aβ的聚集對其他細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄水平的影響并不明顯(圖4)。
圖4 AD對其他細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄水平的影響
(二)四、AD患者的腦與小鼠模型具有明顯的差異性
為更準(zhǔn)確的反映AD病程對人腦的影響,研究者們繼續(xù)利用snRNA-Seq技術(shù)分析了TREM2-CV,TREM2-R62H,和Controls 三種人腦樣本共66311個(gè)細(xì)胞核。與正常人腦相比,AD患者的腦細(xì)胞中NEFL+ NEFM+的神經(jīng)細(xì)胞(Ex1)明顯減少,這與前人研究AD病患神經(jīng)元細(xì)胞丟失的結(jié)果相一致(圖5)。
同樣在人腦中進(jìn)行差異基因分析發(fā)現(xiàn),許多神經(jīng)元基因下調(diào),與小鼠模型相比,穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因TMEM119,P2RY12,CX3CR1反而在AD患者的腦中上調(diào)表達(dá)。并且IRF8作為差異基因也在AD病患的腦中上調(diào)。這一特征不禁讓人聯(lián)想到周圍神經(jīng)損傷(PNI)小鼠模型,IRF8驅(qū)動的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平變化與其非常相似(圖5 c-j)。
圖5 snRNA-Seq構(gòu)建AD人腦轉(zhuǎn)錄圖譜
(五)AD擾亂星形膠質(zhì)與神經(jīng)元的代謝協(xié)調(diào)性
比較AD患者和正常腦的基因表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)髓鞘形成相關(guān)基因(STMN4,SEMA3B,MIR219A2)在少突膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)表達(dá),而CA2,SLC38A2,MID1IP1等基因卻上調(diào)表達(dá),這樣的表達(dá)模式與AD病程致使的神經(jīng)元軸突退化表型具有一致性。另一方面,5×FAD小鼠模型少突膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的Serpina3n和C4b,在人腦中其同源基因SERPINA3和C4B卻是在星形膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)(圖6)。這一發(fā)現(xiàn)從側(cè)面反映出人腦和鼠腦在進(jìn)化過程中的差異性。利用NanoString基因表達(dá)分析,檢測到小膠質(zhì)細(xì)中IRF8基因和少突膠質(zhì)細(xì)胞中的CA2基因在AD樣本中均上調(diào)表達(dá),與snRNA-Seq結(jié)果相吻合。同時(shí)對代謝通路的分析也反映出AD病程會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞衰退,認(rèn)知能力下降的AD病理特征。
圖6 snRNA-Seq和NanoString基因表達(dá)分析解析AD人腦膠質(zhì)細(xì)胞變化
(六)AD人腦中TREM2對小膠質(zhì)細(xì)胞的影響
無論是前人研究還是本文小鼠模型的探究,不斷說明著小膠質(zhì)細(xì)胞在AD病程中的重要性,并且本文還利用小鼠模型證明了Trem2受體在小膠質(zhì)響應(yīng)AD病程中的關(guān)鍵性。最后研究者們?yōu)榱颂接慣REM2在人的AD病程是否也具有相似的作用,對TREM2-CV、TREM2-R26H和TREM2-R47H樣品進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞對AD的響應(yīng)在三個(gè)樣品中存在差異,TREM2-R26H和TREM2-R47H的表型反應(yīng)不如正常人腦,證實(shí)了小鼠模型中的結(jié)論,小膠質(zhì)細(xì)胞在AD病程中的響應(yīng)過程是依賴于TREM2受體的(圖7)。
圖7 R62H和R47H突變型降低了小膠質(zhì)細(xì)胞對AD的響應(yīng)
總的來說,本文研究者主要利用snRNA-Seq技術(shù),先后在小鼠模型和人中證明了小膠質(zhì)細(xì)胞在AD病程中的重要性,同時(shí)通過人和鼠的比較,發(fā)現(xiàn)了AD病程在人和鼠之間存在一定的差異性。
論文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41591-019-0695-9(DOI: 10.1038/s41591-019-0695-9)
烈冰生物已正式上線單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序、AbSeq、單細(xì)胞TCR-Seq、單細(xì)胞ATAC-Seq、空間轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)品。結(jié)合優(yōu)質(zhì)的scRNA-Seq服務(wù),多組學(xué)聯(lián)合助力科研人員探索時(shí)空等多維度、全方位的動態(tài)變化的生物學(xué)信息。烈冰生物為您提供優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞研究完整解決方案!歡迎垂詢!
掃描下方二維碼關(guān)注“烈冰生物”公眾號,獲取更多信息!