分析思路：

檢測樣本信息：

PBMC，腦組織，腦脊液

檢測平臺：

質(zhì)譜流式細胞技術(shù)，免疫組織化學，Plate-seq，Drop-seq（10X Genomics）

研究結(jié)果：

1. AD患者外周血CD8⁺ T_EMRA細胞增多且與認知能力呈負相關(guān)

研究者通過多個隊列分析來評估AD的適應(yīng)性免疫（圖1a），使用質(zhì)譜流式細胞技術(shù)研究了AD患者和前驅(qū)輕度認知障礙（MCI）患者的外周血單個核細胞（PBMC）。然后使用聚類計算方法(spanning-tree progression analysis of density-normalized events，SPADE)進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)患有MCI或AD的患者存在細胞數(shù)顯著增多的CD8⁺群體（圖1b），即cluster 63。該細胞群體的標志物與CD3⁺CD8⁺CD27^- T效應(yīng)記憶CD45RA⁺（T_EMRA）細胞標志物相一致（圖1d），是一種能夠分泌促炎性細胞因子和細胞毒性分子的具有效應(yīng)性功能的細胞群體。

為了進一步研究CD8⁺ T細胞在MCI和AD中的作用，研究者在Cohort 2（圖1a）中評估了認知與記憶T細胞種群之間的關(guān)系。揭示了在MCI和AD中，CD8⁺ TEMRA細胞與認知能力呈負相關(guān)（圖1e）。使用PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)刺激PBMC后，來自MCI或AD患者的CD8⁺ T細胞的IFN-γ水平明顯高于對照CD8⁺ T細胞（圖1f），即MCI或AD患者的外周CD8⁺ T細胞相較于正常人存在一定的功能差異。然后對CD8⁺ TEMRA細胞進行drop-seq單細胞測序且通過差異表達和通路分析發(fā)現(xiàn)，MCI和AD患者中CD8⁺TEMRA細胞的氨基酸代謝顯著減少，TCR和細胞因子信號傳導(dǎo)增加（圖1g，h）。

以上結(jié)果表明，與對照組相比，MCI和AD患者的外周CD8⁺ TEMRA細胞具有更大的抗原刺激性。

圖1 MCI/AD患者中發(fā)現(xiàn)的TEMRA細胞受到抗原刺激性更大

2. CD8⁺ T細胞進入AD患者的大腦

接下來研究者為了確定AD患者的大腦中是否存在CD8⁺ T細胞，對Cohort 3（圖1a）中正常人和AD患者的大腦進行CD8和Aβ免疫組化實驗，以及CD8⁺ T細胞與大腦血管接近程度的分析。發(fā)現(xiàn)在三個AD大腦海馬區(qū)，伴有腦淀粉樣血管病變的血管周隙中存在大量血管外CD8⁺ T細胞（圖2a），受AD影響的海馬中CD3⁺CD8⁺ T細胞明顯多于對照海馬（圖2b），且CD8⁺ T細胞與微管相關(guān)蛋白2 (MAP2)⁺神經(jīng)元具有一定的相關(guān)性（圖2c）。最后研究者從AD患者的大腦海馬附近的軟腦膜中也檢測到了CD3⁺CD8⁺ T細胞（圖2d）。

以上研究結(jié)果表明，在AD患者的大腦中檢測到了CD8⁺ T細胞的存在。

圖2 AD患者大腦中檢測到CD8⁺ T細胞

3. AD患者腦脊液中CD8⁺ TEMRA細胞的克隆擴增

CD8⁺ T細胞在腦軟腦膜的定位促使研究者想要繼續(xù)探索抗原特異性細胞是否也在CSF中存在。研究者發(fā)現(xiàn)健康老年受試者的CSF中的免疫細胞主要包含T細胞，以及少量的先天免疫細胞和微量的B細胞，其中CD8⁺ T細胞群幾乎完全由效應(yīng)記憶性T細胞（T effector memory，T_EM）細胞組成，TEMRA細胞約占該T_EM群的20％。

在接下來的研究中，研究者使用plate-seq和drop-seq兩種測序方法進行T細胞的克隆擴增評估，患者數(shù)據(jù)均來源于Cohort 4（圖1a）。發(fā)現(xiàn)在CSF的T細胞中主要是CD8⁺T細胞發(fā)生克隆擴增，其中一位AD患者的存在大量擴增的克隆，占CD8⁺ T細胞的44％（圖3b）。隨后Marker基因鑒定發(fā)現(xiàn)該克隆為CD8⁺ CD45RA ⁺ CD27^- TEMRA細胞（圖3c）。這項發(fā)現(xiàn)首次提出了受年齡相關(guān)神經(jīng)退行性病變影響的大腦腦脊液中存在克隆擴增的CD8⁺ T細胞。

研究者使用drop-seq對CSF細胞進行細胞分群時同樣發(fā)現(xiàn)大多數(shù)CSF細胞是T細胞（圖3d,e）。然后對這些細胞進行了單細胞TCR測序（scTCR-seq），發(fā)現(xiàn)來自MCI或AD患者的CSF細胞中有許多高度擴增的CD8⁺克隆，而對照組則相反（圖3f,g,h）。通過差異表達分析發(fā)現(xiàn)MCI和AD中高度擴增的克?。淳哂形鍌€以上相同TCRαβ序列的T細胞）表現(xiàn)出細胞毒性效應(yīng)基因的表達增加（圖3i）。通過占比分析發(fā)現(xiàn)49.13％的克隆擴增細胞是CD8⁺ TEMRA細胞（圖3j），且MCI和AD中的這類細胞同樣表現(xiàn)為細胞毒性效應(yīng)基因表達的增加。尤其在MCI和AD病患中高表達影響認知的衰老因子人類白細胞抗原C（HLA-C）和β-2-微球蛋白（B2M）以及其他與AD相關(guān)的基因。（圖3k）。研究者還發(fā)現(xiàn)CD8⁺ T細胞中GZMA基因的表達（圖3l）以及AD患者海馬中GZMA⁺ CD8⁺細胞具有更高的百分比（圖3m）。

以上結(jié)果揭示了AD患者的CSF中CD8⁺ TEMRA克隆細胞的促炎和細胞毒性功能。

圖3 AD患者的CSF中CD8⁺ TEMRA細胞發(fā)生克隆擴增且具有促炎功能

4.AD患者腦脊液中克隆擴增TCRs的抗原鑒定

接下來，研究者希望確定是何種抗原引起了CD8⁺ TEMRA細胞的克隆擴增。通過構(gòu)建TCRαβ序列的未加權(quán)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)一例MCI和一例AD患者間具有一個共享的克隆，而另一例AD患者共享了其中的TCRβ序列，這條TCRβ序列（CASSLGQAYEQYF）對一種皰疹病毒EBV的EBNA3A抗原（Herpesviridae Epstein–Barr nuclear antigen 3）具有特異性（圖4b），并在該克隆中發(fā)現(xiàn)細胞毒性效應(yīng)基因表達增加（圖4c）。隨后研究者使用GLIPH算法對未知的TCR序列進行特異性抗原的確定。發(fā)現(xiàn)AD患者共享的TCRβ鏈（CASSLAGGYNEQFF）與第三位AD患者的TCRβ鏈（CASSLGTGNNEQFF）具有同源性（圖4d）。

通過構(gòu)建表達TCRαβ1和TCRαβ2細胞系，發(fā)現(xiàn)TCRαβ1細胞對MHC-1肽庫有反應(yīng)，而TCRαβ2細胞無反應(yīng)（圖4e）。然后將TCRαβ2作為對照，發(fā)現(xiàn)只有一個肽段激活了TCRαβ1細胞，即來源于EB病毒反式激活蛋白BZLF1的7-RAKFKQLL（圖4f,g）。

以上，研究者通過對TCR的測序及分析發(fā)現(xiàn)了AD中一種新型的TCR，對EBV反式激活蛋白BZLF1具有特異性。

圖4 AD患者CSF細胞中TCR的抗原鑒定

綜上所述，研究者通過對TCR序列的分析證明了AD中CD8⁺ T細胞的抗原特異性克隆的擴增，并鑒定出EBV抗原的特異性TCR，雖然還不足以說明EBV感染與AD之間有明確的因果關(guān)系，但通過分析TCR，鑒定克隆以及通過TCR識別抗原的方法將會為研究神經(jīng)退行性疾病的適應(yīng)性免疫提供新的途徑。

原文鏈接：http://nature.webvpn.ustc.edu.cn/articles/s41586-019-1895-7

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