前方高能！單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)人員請(qǐng)迅速集合！迅速集合！

上回說到，走在生命科學(xué)研究前沿的急先鋒們，已經(jīng)了解了單細(xì)胞測(cè)序在各自研究方向上的應(yīng)用與價(jià)值，正摩拳擦掌準(zhǔn)備大干一番，卻遇到了重重障礙。今天，我們就來聊一聊單細(xì)胞測(cè)序第一個(gè)“攔路虎”----單細(xì)胞消化與懸液制備，以及實(shí)驗(yàn)過程中潛在的那些“坑”。

目前，單細(xì)胞測(cè)序的主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)槿祟愥t(yī)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、遺傳生殖、干細(xì)胞等研究領(lǐng)域，涉及到的主要樣品類型十分廣泛，但根據(jù)其來源，可分為如下幾個(gè)大類：1）腫瘤組織，如肝癌、胃癌、乳腺癌等；2）實(shí)體組織來源的原代分離細(xì)胞，如腦神經(jīng)元、腸道組織來源的上皮及干性細(xì)胞等；3）血液來源的某些細(xì)胞亞群（一般可以通過不同biomarker進(jìn)行FACS分選），如通過5色標(biāo)記的造血干細(xì)胞群體；4）干細(xì)胞誘導(dǎo)分化/重編程相關(guān)的細(xì)胞樣品。

如何根據(jù)自己課題的方案設(shè)計(jì)及樣品類型，選擇合適的單細(xì)胞制備方法，是事關(guān)成敗的第一要素！（生信分析的同學(xué)先冷靜一下，沒說你們不重要，畢竟好的樣品通過好的測(cè)序技術(shù)得到好的RAW DATA才能發(fā)揮你們的生信優(yōu)勢(shì)對(duì)不！）CNS文章里的方法學(xué)，寫的都很(bu)經(jīng) (xi) 典(zhi)，看了之后還是一頭霧水。質(zhì)量濃度單位還是活性濃度單位？That is a question.

因此烈冰的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)決定自己動(dòng)手做一批動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，摸索并優(yōu)化出一套更適用的單細(xì)胞懸液制備方案。

l 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕容^不同類型膠原酶消化針對(duì)不同類型組織的消化效果，摸索出適用于小鼠不同組織器官（如心、肝、脾、肺、腎和腦）的消化條件。

l 實(shí)驗(yàn)材料：剪刀、鑷子等器械需提前滅菌處理，RPMI-1640，FBS，D-Hanks`緩沖液(也可以換成含有Ca²⁺的HBBS)。膠原酶I/II/IV/V（具體類型及對(duì)應(yīng)貨號(hào)如下圖）。

l 實(shí)驗(yàn)方法：以肝臟、心臟為例，進(jìn)行演示，詳細(xì)流程及注釋事項(xiàng)如下圖所示。

注釋事項(xiàng)：

① 解剖小鼠，取其具體靶器官時(shí)，一般采取斷頸的方式，優(yōu)勢(shì)是處理快速、方法通用，但會(huì)引起體內(nèi)局部（尤其是胸腔）內(nèi)凝血，對(duì)心臟、主動(dòng)脈和肺等組織有一定影響；解剖過程，務(wù)必快速準(zhǔn)確，盡量減少細(xì)胞活性的損失；

② 沖洗過程，一般采用預(yù)冷的生理鹽水/PBS/D-Hanks`液/RPMI-1640等液體。此步驟注意兩點(diǎn)：預(yù)冷+維持細(xì)胞活性的“液體”。一般情況下，建議RPMI-1640添加FBS至10%終體積（其實(shí)就是完全培養(yǎng)液）。也有老師用終濃度1-5%的BSA，其實(shí)作用都是為了提高細(xì)胞懸液制備過程中的細(xì)胞活性。

③ 剪碎過程，注意兩點(diǎn)：快速+越小越碎越好?？梢詼?zhǔn)備一次性的平皿，提前注入5-10 ml預(yù)冷的完全培養(yǎng)液，在預(yù)冷環(huán)境中剪碎組織。

④ 膠原酶消化，這一步注意事項(xiàng)較多。首先，明確適用于該組織的膠原酶，詳細(xì)情況見上面表格；一般情況下，IV型最通用，但特殊類型的組織用單一類型的酶效果更好；另外，根據(jù)研究目的，如果樣品所處微環(huán)境組織類型復(fù)雜，可以配成混合型的膠原酶，如II+IV型；第二，使用終濃度，我們整理了20+的CNS文章，發(fā)現(xiàn)有作者用質(zhì)量濃度mg/ml，也有的用活性單位濃度UI/ml，考慮到各公司貨品單位質(zhì)量對(duì)應(yīng)的活性不同，建議以活性單位濃度UI/ml為基準(zhǔn)。大多數(shù)的II或IV型膠原酶的使用濃度為100-200 UI/ml。最后，注意消化時(shí)間。一般情況下，膠原酶在37℃條件下活性最強(qiáng)，消化時(shí)間為20-30 min；也有文章在處理腫瘤組織時(shí)，消化4 h甚至過夜。不敢多想，深表懷疑。另外，也有老師喜歡用4℃消化過夜的方式，細(xì)胞數(shù)量和活性也都還不錯(cuò)，可以嘗試，但可能不會(huì)通用于所有類型的組織。

⑤ 終止酶的消化，一般來說都是加入血清的。但是，由于膠原酶本身不受血清影響，因此，只能采用離心—棄上清—加培養(yǎng)液重懸的“素質(zhì)三連”來洗去殘留的膠原酶。至于細(xì)胞碎片，這一步基本上都是通過低轉(zhuǎn)速短時(shí)間離心的方式進(jìn)行的，基本上300 g，5 min即可。既保證活細(xì)胞離心收集，又保證細(xì)胞碎片懸浮在上清中被棄掉。如果，老式離心機(jī)只能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速（rpm），沒有g(shù)這一選項(xiàng)的話，一般情況下是1000-1500 rpm。

⑥ 紅細(xì)胞裂解，這一步其實(shí)很糾結(jié)。先說結(jié)論，該裂還是要裂的，不過盡量在初步分離細(xì)胞的時(shí)候把紅細(xì)胞去除干凈。不過，像心臟和肝臟這樣的組織，本身紅細(xì)胞含量就超級(jí)高，裂紅在所難免。至于為什么糾結(jié)，因?yàn)橛行┘?xì)胞類型被裂紅試劑處理后，會(huì)發(fā)生聚集并收縮在一團(tuán)，用移液器輕微的吹打不容易將其分開，會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的單細(xì)胞得率。

⑦ 最終，在檢測(cè)細(xì)胞活性/數(shù)量的時(shí)候，再啰嗦幾句。以本人十幾年的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)（暴露年齡了），要么走經(jīng)典路線，光學(xué)顯微鏡+細(xì)胞計(jì)數(shù)板+臺(tái)盼藍(lán)；要么走高科技路線，活/死細(xì)胞熒光染料染色后全自動(dòng)計(jì)數(shù)儀操作。這里不建議用臺(tái)盼藍(lán)染色，再全自動(dòng)計(jì)數(shù)的儀器，貴不貴不是最重要的，關(guān)鍵是不準(zhǔn)確，且批次間可重復(fù)性太低，低到你崩潰。明明鏡下觀察活性相當(dāng)客觀，為何全自動(dòng)說細(xì)胞都掛了呢，不思其解。問了周圍的小伙伴，以及銷售器材的一些朋友，確實(shí)也有不少人碰到過這一情況。

最后，給大家提一些單細(xì)胞懸液制備的注意事項(xiàng)：

1） 針對(duì)具體組織類型選對(duì)酶，以及使用濃度；多種類型組織共存，可配置混合型酶反應(yīng)液；提前摸索活性濃度；

2） 酶干粉配置母液時(shí)要含有Ca2+離子才能激活活性；

3） 需要預(yù)冷的，需要室溫的，或者需要37℃的，都提前準(zhǔn)備好。一般情況下，酶消化用37℃，其他分離過程用4℃減少活性損失（包括離心）；

4） 組織剪的越小，分離效果越好；

5） 離心機(jī)最好是帶g的，300 g+5 min通用全程；不帶g的話，1000-1500rpm即可，轉(zhuǎn)速過高，細(xì)胞活性會(huì)受影響，碎片也越多。

6）說了這么多，希望對(duì)大家的實(shí)驗(yàn)有幫助。如果還有其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)疑問，可以關(guān)注我們的微信公眾號(hào)（烈冰生物），烈冰還會(huì)陸續(xù)分享更多關(guān)于單細(xì)胞測(cè)序的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和數(shù)據(jù)分析技巧。

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