服務(wù)熱線02152235399
自烈冰生物關(guān)鍵技術(shù)——冷凍切片制備亮相以后，很多老師都對(duì)烈冰的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序保持極大地關(guān)注，尤其之前小編請(qǐng)到了實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)大神Dr.Han親自上手，結(jié)合實(shí)際操作詳細(xì)介紹了樣本制備的整個(gè)過程，老師們紛紛反饋?zhàn)⒁獾搅撕芏嘀昂雎缘募?xì)節(jié)操作。
那么，本期小編就持續(xù)高能輸出技術(shù)干貨，介紹一下烈冰生物的數(shù)字切片掃描成像方案以及空轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)的核心步驟——組織透化優(yōu)化，全程高能，做好準(zhǔn)備哦~
掃描成像的分辨率是影響組織切片原始圖像信息精度和準(zhǔn)確度的重要因素。將組織切片掃描為包含所有組織信息的高分辨率電子圖片，可以在電腦上進(jìn)行放大和縮小，如同在顯微鏡上操作一樣，真正將物質(zhì)的切片標(biāo)本快速數(shù)字化，實(shí)現(xiàn)病理數(shù)字閱片。
組織透化是指將組織切片放置在含有與 RNA 結(jié)合捕獲探針的載玻片上,固定染色后，通過透化酶處理的方式,使細(xì)胞中的 mRNA 釋放并結(jié)合到相應(yīng)的捕獲探針上,從而獲取基因表達(dá)信息。 這個(gè)過程需要對(duì)透化時(shí)間進(jìn)行一個(gè)很好的把控，透化時(shí)間不夠，mRNA無法充分釋放出來；透化時(shí)間過長(zhǎng)，mRNA可能會(huì)擴(kuò)散到附近區(qū)域，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)人員的操作手法、組織類型、切片厚度等因素不同，最佳透化時(shí)間也不盡相同。因此在正式的組織透化實(shí)驗(yàn)之前，通常需要對(duì)組織進(jìn)行透化優(yōu)化，以確定最佳透化時(shí)間。
下面就以腦組織的冷凍切片為例詳細(xì)介紹一下組織透化時(shí)間的優(yōu)化過程。
首先，準(zhǔn)備好組織優(yōu)化的冷凍切片，進(jìn)行固定、HE染色，然后在明場(chǎng)光源下進(jìn)行掃描成像。
固定及HE染色具體步驟：
1 ）將芯片放在PCR儀上，37°C下孵育1分鐘。
2 ）將芯片完全浸入預(yù)冷的甲醇中在-20°C孵育30分鐘。
3 ）玻片取出，擦干背面液體，在玻片上滴加500μl異丙醇，室溫孵育1分鐘；
4 ）將芯片上試劑去除，晾干玻片；
5 ）加入1 ml蘇木精，室溫孵育7分鐘；
6 ）去除蘇木精試劑，然后將芯片先浸入無酶水中清洗后，晾干；
7 ）加入1 ml Bluing Bu?er，室溫孵育2分鐘；
8 ）去除試劑，將芯片浸入無酶水清洗后，擦干玻片背面液體；
9 ）加入1 ml伊紅混合物，室溫孵育1分鐘；
10） 去除試劑，將芯片浸入無酶水中清洗，晾干直至組織不透明。
11 ）在37°C下孵育芯片5分鐘后，進(jìn)行明場(chǎng)成像實(shí)驗(yàn)。
組織透化優(yōu)化：
組織優(yōu)化芯片包含8個(gè)捕獲區(qū)域：
組織透化具體步驟:
1）將芯片放在芯片盒中，陽(yáng)性和陰性對(duì)照均不加透化酶。
2 ) 在透化30min的孔中添加70μl透化酶，放置在37°C的PCR適配器上。
3 ) 6分鐘后，向透化24min的孔中添加70μl通透酶，并在37°C的PCR適配器上孵育，
4) 重復(fù)此過程，直至27min后，向透化3min的孔添加70μl透化酶，放置在37°C的PCR適配器上。
5) 從每個(gè)孔中除去透化酶，陽(yáng)性對(duì)照以外的所有孔中添加100μl 0.1X SSC，
6) 從每個(gè)孔中移出0.1X SSC。向每個(gè)孔中加入50μl Fluorescent RT Master Mix，將其放在預(yù)熱的PCR儀（設(shè)置條件）以啟動(dòng)cDNA合成。
7) 從孔中吸出Fluorescent RT Master Mix，向每個(gè)孔中添加100μl 0.1X SSC，
8) 從每個(gè)孔中吸出0.1X SSC。向每個(gè)孔中加入70μl Tissue Removal Mix，然后放在PCR儀適配器上孵育，
9) 從孔中吸出Tissue Removal Mix。從芯片盒中取出芯片，浸入預(yù)熱的2X SSC-0.1％SDS中15次，浸入0.2X SSC中15次，浸入0.1X SSC中15次。
10) 在載片旋轉(zhuǎn)器中離心30s，確認(rèn)芯片上沒有剩余的組織。
通過數(shù)字切片掃描儀在熒光場(chǎng)下進(jìn)行掃描成像?？梢悦黠@看出隨著透化時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度先逐漸增強(qiáng)，透化12min時(shí)熒光亮度達(dá)到最亮，而后逐漸減弱。
如果熒光強(qiáng)度接近，可以選擇較長(zhǎng)的透化時(shí)間，防止透化不充分。但透化時(shí)間并不是越長(zhǎng)越好，隨著時(shí)間增加，細(xì)胞內(nèi)釋放的RNA會(huì)擴(kuò)散，進(jìn)入附近組織區(qū)域，放大看到海馬區(qū)結(jié)構(gòu)模糊，或向邊緣擴(kuò)散，沒有熒光信號(hào)的區(qū)域也出現(xiàn)了熒光信號(hào)。所以，在選擇最佳透化時(shí)間時(shí)，應(yīng)綜合考慮熒光強(qiáng)度以及RNA擴(kuò)散程度。
選擇最佳的透化時(shí)間后，就可以進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)了。正式實(shí)驗(yàn)流程與組織透化優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)流程基本一致，只是所用芯片不一樣。正式實(shí)驗(yàn)用的基因表達(dá)芯片上有4個(gè)捕獲區(qū)域，其實(shí)驗(yàn)流程為：
冷凍切片及貼片→甲醇固定→HE染色→明場(chǎng)拍照→透化→cDNA合成→第二鏈cDNA合成→變性→cDNA擴(kuò)增→純化和質(zhì)控→片段化，末端修復(fù)，加A→連接頭→樣本index PCR→上機(jī)測(cè)序。
熱點(diǎn)回顧：
