烈冰生物已經(jīng)正式推出了Visium空間轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析服務(wù)，（技術(shù)搶先看|全新空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析策略來咯~）為了更好地幫助客戶理解空間轉(zhuǎn)錄組測序，得到完美的組織切片，獲得最優(yōu)質(zhì)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，本期開始，小編將為大家詳細(xì)介紹空間轉(zhuǎn)錄組測序的原理、樣本制備、實(shí)驗(yàn)流程、案例分析、文章解讀等信息。

其實(shí)，空間轉(zhuǎn)錄組的概念早在2016年就已經(jīng)存在了，目前已經(jīng)發(fā)表的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)有 Slide-seq、LCM-seq、seqFISH、MERFISH、Liver single cell zonation以及 Tomo-seq。但是這些方法存在操作復(fù)雜、檢測精度不準(zhǔn)確、基因和細(xì)胞檢測量的限制等問題，無法大規(guī)模商業(yè)推廣。

基于Spatial Transcriptomics升級(jí)改進(jìn)后的Visium空間轉(zhuǎn)錄組，是目前唯一一款高精度、高通量的商業(yè)化空間轉(zhuǎn)錄組測序方案，工作流程簡單，從組織切片到文庫構(gòu)建僅需一天，大大節(jié)省時(shí)間成本。其本質(zhì)是通過空間條形碼捕獲探針，高通量的原位檢測冷凍組織切片中不同區(qū)域的RNA的表達(dá)模式以及空間分布。

當(dāng)組織冷凍切片附在帶有spatial barcode的空間轉(zhuǎn)錄組載片上時(shí)，通過探針上條形碼引物結(jié)合并從組織中捕獲鄰近的mRNA。被捕獲的mRNA開始逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA中包含了spatial barcode序列。通過上機(jī)測序，可以將每個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄的序列映射回組織切片中的起始位置。

Visium空間轉(zhuǎn)錄組的核心在于載玻片部分，正式文庫構(gòu)建的載玻片上有4個(gè)捕獲區(qū)域（6.5mm X 6.5mm，可以加4個(gè)樣本），每個(gè)捕獲區(qū)域含有約5000個(gè)被條形碼標(biāo)記的點(diǎn)（barcoded spots），每個(gè)spot直徑55μm，spot與spot中心點(diǎn)之間的距離為100μm，每個(gè) spot含有上百萬個(gè)可以與mRNA結(jié)合的捕獲探針，每個(gè)探針上都帶有獨(dú)特的spatial barcodes，用以標(biāo)記捕獲的mRNA的空間位置。

空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)流程

因?yàn)榭臻g轉(zhuǎn)錄組測序是對組織切片進(jìn)行操作，需要將組織進(jìn)行切片。因此客戶在制備樣本時(shí)，需要將新鮮的組織凍存并進(jìn)行OCT包埋。 后續(xù)的冷凍切片、RNA 捕獲及文庫構(gòu)建等操作可以視具體情況帶回公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1、組織凍存

將組織進(jìn)行凍存的目的是為了得到保護(hù)RNA的質(zhì)量及組織形態(tài)的完整，從而真實(shí)的反映出細(xì)胞和基因在空間中的分布情況。因此，拿到新鮮組織后，需要對組織樣本進(jìn)行異戊烷速凍。

2、OCT包埋

OCT是一種固形劑，在冰凍切片時(shí)可以支撐組織，增加組織的連續(xù)性，減少皺折及碎裂，以保存組織結(jié)構(gòu)完整性。

3、冷凍切片

將質(zhì)檢合格的冷凍組織和10x玻片先放-20℃冷凍切片機(jī)箱體中平衡30分鐘以上，再進(jìn)行切片。

4、文庫構(gòu)建

將組織切片貼合在帶有mRNA結(jié)合捕獲探針的載玻片上，通過甲醛固定、H&E染色并拍照得到組織切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)。再進(jìn)行透化處理，使細(xì)胞中的mRNA釋放，并結(jié)合到芯片相鄰的捕獲探針上。將捕獲的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并構(gòu)建測序文庫進(jìn)行上機(jī)測序，從而獲取基因表達(dá)信息。

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總體來說，空間轉(zhuǎn)錄組的實(shí)驗(yàn)流程包括：組織凍存-OCT包埋-冷凍切片-固定染色-組織透化-cDNA合成及建庫-上機(jī)測序，而需要客戶進(jìn)行樣本準(zhǔn)備的步驟相對簡單：組織凍存與OCT包埋。

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